桔小實(shí)蠅幾丁質(zhì)合成通路上3個(gè)基因的cDNA克隆及功能分析.pdf

1、桔小實(shí)蠅Bactrocera dorsalis(Hendel)隸屬于雙翅目(Diptera)，實(shí)蠅科(Tetrphitidae)，果實(shí)蠅屬（Bactrocera macpuart），寄主范圍廣，是為害多種水果和蔬菜的世界性害蟲。自傳入我國(guó)以來(lái)，迅速擴(kuò)散至廣東、廣西、臺(tái)灣等沿海地區(qū)，近年來(lái)自南向北繼續(xù)擴(kuò)散至江蘇、浙江、湖北等省市。桔小實(shí)蠅主要通過(guò)幼蟲在果實(shí)內(nèi)部危害，導(dǎo)致瓜果腐爛、脫落，而造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。這種特殊的危害方式導(dǎo)致幼蟲的危害

2、在早期難以被發(fā)現(xiàn)，而傳統(tǒng)的化學(xué)防治也難以達(dá)到防控的目的。昆蟲生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑以其環(huán)保且對(duì)人畜無(wú)害等優(yōu)點(diǎn)成為研究的熱點(diǎn)，它的作用靶標(biāo)較多，幾丁質(zhì)就是其中之一。幾丁質(zhì)廣泛存在于節(jié)肢動(dòng)物、線蟲、酵母等非哺乳動(dòng)物體內(nèi)，由于其存在的特殊性而引起研究者們的廣泛興趣——作為害蟲防治的靶標(biāo)研發(fā)新型環(huán)保農(nóng)藥等生物制劑，從而達(dá)到田間防控害蟲的目的。幾丁質(zhì)的合成是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，至少需要8種酶的共同參與，其中某一個(gè)過(guò)程受阻就會(huì)導(dǎo)致幾丁質(zhì)的合成受阻，導(dǎo)致昆蟲因缺少幾

3、丁質(zhì)而不能存活。本學(xué)位論文針對(duì)參與幾丁質(zhì)合成通路上的3個(gè)重要的酶（幾丁質(zhì)合成酶2，Chitin synthase2;葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶，Glucose-6-phosphate isomerase;UDP-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶，UDP-N-acetylglucosamine pyrophosphorylase），通過(guò)分子克隆，定量表達(dá)，饑餓飼喂，幾丁質(zhì)含量測(cè)定，抑制劑生物測(cè)定等方法，對(duì)桔小實(shí)蠅這3個(gè)基因的分子生物學(xué)特性進(jìn)行了初步的

4、研究，主要結(jié)果如下:
　　 1.桔小實(shí)蠅幾丁質(zhì)合成通路上BdCHS2、BdG6PI和BdUAP基因的cDNA全長(zhǎng)克隆及序列分析
　　 從本實(shí)驗(yàn)室測(cè)序獲得的桔小實(shí)蠅轉(zhuǎn)錄組中獲取相應(yīng)的Unigene片段，通過(guò)Overlapping技術(shù)獲得cDNA大片段，然后結(jié)合cDNA末端快速擴(kuò)增(rapid amplification of cDNA ends，RACE)技術(shù)，成功地從桔小實(shí)蠅體內(nèi)分離克隆獲得3個(gè)幾丁質(zhì)合成通路上的基因Bd

5、CHS2、BdG6PI和BdUAP的cDNA全長(zhǎng)序列，GenBank登錄號(hào)分別為KC354694、JQ925874及JX434756。通過(guò)序列分析，明確了這3個(gè)通路基因的開放閱讀框，并推導(dǎo)了其編碼的氨基酸序列。進(jìn)一步利用相應(yīng)的軟件預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、保守基序、跨膜結(jié)構(gòu)等生理功能。另外，從NCBI上下載其他物種相應(yīng)基因的cDNA序列，借助Mega5.04軟件并應(yīng)用Neighbor Joining方法構(gòu)建相對(duì)應(yīng)的系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)一步明確與其

6、他物種之間的遺傳距離。該研究結(jié)果豐富和發(fā)展了桔小實(shí)蠅幾丁質(zhì)合成通路基因的遺傳信息，為深入探討幾丁質(zhì)合成機(jī)制提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
　　 2.桔小實(shí)蠅幾丁質(zhì)合成通路上BdCHS2、BdG6PI和BdUAP基因的時(shí)空表達(dá)分析
　　 分別解剖桔小實(shí)蠅7日齡幼蟲5種組織器官（表皮、氣管、中腸、脂肪體和馬氏管），然后提取總RNA及合成第一條cDNA鏈，借助qPCR(Real-time Quantitative PCR)儀，檢測(cè)桔小實(shí)蠅B

7、dCHS2、BdG6PI和BdUAP這3個(gè)基因在不同組織部位的表達(dá)模式。結(jié)果發(fā)現(xiàn)BdCHS2基因在中腸的表達(dá)顯著高于其他4個(gè)組織;BdG6PI基因主要分布于脂肪體和馬氏管中;BdUAP主要分布在表皮、馬氏管和中腸中;BdCHS2、BdG6PI和BdUAP在氣管中表達(dá)量均低。不同組織器官的定量表達(dá)，豐富了對(duì)這3個(gè)基因的認(rèn)識(shí)。
　　 分別收集獲得卵、幼蟲、蛹和成蟲（卵、1-8日齡幼蟲、1-10日齡蛹以及新羽化的成蟲）等4個(gè)蟲態(tài)的桔小

8、實(shí)蠅，然后提取總RNA及合成第一鏈cDNA，通過(guò)qPCR檢測(cè)幾丁質(zhì)合成通路上BdCHS2、BdG6PI和BdUAP基因在不同發(fā)育階段的表達(dá)模式。結(jié)果顯示桔小實(shí)蠅BdCHS2、BdG6PI和BdUAP基因在整個(gè)發(fā)育階段均有所表達(dá)，尤其在幼蟲和成蟲期的表達(dá)量高于卵期和蛹期，且不同基因在不同發(fā)育階段的表達(dá)量存在差異。研究結(jié)果明確了這3個(gè)基因在各個(gè)時(shí)期的表達(dá)情況，為后續(xù)基因功能的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)提供了前提條件。
　　 3.桔小實(shí)蠅饑餓及飼喂后幾

9、丁質(zhì)合成通路上BdCHS2、BdG6PI和BdUAP基因定量表達(dá)分析
　　 為進(jìn)一步明確饑餓對(duì)桔小實(shí)蠅幼蟲的影響，實(shí)驗(yàn)分別設(shè)置饑餓和飼喂處理24h后，饑餓處理的幼蟲再飼喂24h，飼喂處理的幼蟲再饑餓24h，期間解剖中腸并提取總RNA及合成第一鏈，通過(guò)qPCR技術(shù)檢測(cè)桔小實(shí)蠅幼蟲經(jīng)過(guò)饑餓-飼喂處理后BdCHS2、BdG6PI和BdUAP這3個(gè)基因在中腸的表達(dá)模式。結(jié)果顯示，桔小實(shí)蠅經(jīng)饑餓后再飼喂，BdCHS2基因的表達(dá)量比飼喂后再

10、饑餓的高，饑餓-飼喂對(duì)該基因影響比較明顯;桔小實(shí)蠅饑餓后再飼喂，BdG6PI基因的表達(dá)量也高于飼喂后再饑餓的處理，而饑餓-飼喂對(duì)桔小實(shí)蠅幼蟲中腸BdUAP基因表達(dá)量的影響不顯著。該研究結(jié)果證實(shí)了饑餓能夠影響桔小實(shí)蠅BdCHS2和BdG6PI基因的表達(dá)，而對(duì)BdUAP基因的表達(dá)影響較低。
　　 4.除蟲脲對(duì)桔小實(shí)蠅幼蟲的影響
　　 挑取桔小實(shí)蠅孵化后1日齡幼蟲，采用浸漬法進(jìn)行除蟲脲的生物測(cè)定。不同濃度除蟲脲處理桔小實(shí)蠅48

11、h后檢測(cè)結(jié)果，求得除蟲脲對(duì)桔小實(shí)蠅1日齡幼蟲的致死中濃度(LC50)為42.05mg/L，且幼蟲出現(xiàn)不能蛻皮而死亡的表現(xiàn)型;qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)低劑量的除蟲脲對(duì)BdCHS2基因沒有顯著性影響。
　　 5.幾丁質(zhì)含量測(cè)定
　　 通過(guò)對(duì)桔小實(shí)蠅幼蟲饑餓-飼喂處理，測(cè)定單頭試蟲中腸幾丁質(zhì)含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，饑餓及飼喂處理對(duì)桔小實(shí)蠅幾丁質(zhì)含量影響顯著，且與定量表達(dá)結(jié)果一致，驗(yàn)證了BdCHS2基因在中腸高表達(dá)這一結(jié)果。通過(guò)測(cè)定桔小實(shí)蠅不同

12、發(fā)育階段的幾丁質(zhì)含量，發(fā)現(xiàn)在卵期至幼蟲階段，其幾丁質(zhì)含量呈幾何乘冪形式增長(zhǎng)，蛹前期幾丁質(zhì)含量較低，后期幾丁質(zhì)含量增高，新羽化成蟲的幾丁質(zhì)含量低于最后一天的蛹。上述結(jié)果與BdCHS2基因在不同發(fā)育階段的定量表達(dá)趨勢(shì)上存在明顯的線性相關(guān)性。
　　 綜上所述，本學(xué)位論文克隆獲得了3個(gè)幾丁質(zhì)合成通路基因(BdCHS2、BdG6PI和BdUAP)cDNA全長(zhǎng)序列，豐富了桔小實(shí)蠅的遺傳信息;在此基礎(chǔ)上，借助qPCR技術(shù)較為全面地解析這3個(gè)基