新型運(yùn)輸輔助劑F5及野生型小鼠在杜興肌肉萎縮癥中的應(yīng)用研究.pdf

1、目的：杜興肌肉萎縮癥（Duchenne muscular dystrophy-DMD）是一種致死性的X染色體連鎖遺傳的神經(jīng)肌肉失調(diào)癥，目前臨床未有任何有效的治療方法。反義寡核苷酸介導(dǎo)的外顯子跳讀療法成為杜興肌肉萎縮癥基因治療中最有應(yīng)用前景的方法之一，但最近III期臨床試驗(yàn)結(jié)果未能達(dá)到預(yù)期目標(biāo)，究其根本原因是由于藥物系統(tǒng)運(yùn)輸效率低所致。因此，亟需研發(fā)新型、高效的運(yùn)輸輔助劑，以提高反義寡核苷酸藥物在肌肉中的系統(tǒng)運(yùn)輸效率。針對(duì)這一關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題

2、，前期工作中，我們?cè)诙排d肌肉萎縮癥小鼠模型測(cè)試了一系列新型運(yùn)輸輔助劑，發(fā)現(xiàn)F5表現(xiàn)出對(duì)反義寡核苷酸藥物活性提高作用。本論文基于前期工作基礎(chǔ)，在杜興肌肉萎縮癥小鼠模型上系統(tǒng)測(cè)試了包括F5在內(nèi)的幾種候選新型運(yùn)輸輔助劑對(duì)不同反義寡核苷酸藥物活性增強(qiáng)作用，進(jìn)而對(duì)效果最佳的F5展開(kāi)全面、系統(tǒng)測(cè)試及安全性評(píng)估，預(yù)期為反義寡核苷酸藥物的系統(tǒng)運(yùn)輸提供一種新途徑和新策略，同時(shí)為新型運(yùn)輸輔助劑的臨床應(yīng)用提供重要實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論指導(dǎo)。另外，本論文還對(duì)其他潛在的

3、杜興肌肉萎縮癥小鼠模型展開(kāi)探索，以期為DMD反義寡核苷酸藥物篩選及杜興肌肉萎縮癥治療研究提供一種更容易獲取和實(shí)用的小鼠模型，可進(jìn)一步加速反義寡核苷酸藥物及DMD新治療方法研發(fā)進(jìn)程。
　　方法：
　　1.基于前期篩選工作，將5種效果較優(yōu)的候選輔助劑（F4、F5、F9、F10及F12）分別與5μg MOE在mdx小鼠的前脛骨肌上進(jìn)行局部肌肉注射，兩周后收取肌肉組織，利用IHC和RT-PCR分別檢測(cè)dystrophin陽(yáng)性肌纖維表

4、達(dá)和分布及外顯子跳讀效率，通過(guò)定量分析以評(píng)估其作用效果。
　　2.將上述5種輔助劑與5μg肽核酸（Peptide Nucleic Acid- PNA）在mdx小鼠上進(jìn)行局部肌肉注射，兩周后收取肌肉組織，利用IHC、RT-PCR及Western Blot在RNA及蛋白水平檢測(cè)外顯子跳讀和dystrophin蛋白恢復(fù)表達(dá)情況，以評(píng)估輔助劑對(duì)PNA活性的增強(qiáng)作用；通過(guò)比較分析，以確認(rèn)同種輔助劑對(duì)不同藥物的作用效果，從而篩選出效果最佳的輔

5、助劑。
　　3.將優(yōu)選輔助劑 F5分別與不同反義寡核苷酸藥物，包括2μg PMO，2μg M12-PMO，1μg B-MSP-PMO和2μg R-PMO，在mdx小鼠上進(jìn)行局部肌肉注射，兩周后收樣，利用IHC、RT-PCR和Western Blot檢測(cè)外顯子跳讀及dystrophin蛋白恢復(fù)表達(dá)情況，以探究F5對(duì)不同反義寡核苷酸藥物的作用效果，從而確定F5與反義寡核苷酸藥物的最佳組合。
　　4. F5濃度效應(yīng)研究，通過(guò)降低或

6、提高F5濃度（F5A為2.5％；F5B為7.5%）與組合效果最優(yōu)的PMO進(jìn)行局部肌肉注射，兩周后收樣，利用上述檢測(cè)方法在RNA和蛋白水平上，分別測(cè)試外顯子跳讀效率和dystrophin蛋白恢復(fù)表達(dá)情況，與F5（5%）比較，從而確定F5最佳使用濃度。
　　5.為評(píng)估F5對(duì)PMO系統(tǒng)增強(qiáng)作用，將25 mg/kg的PMO通過(guò)尾靜脈注射到成年mdx小鼠中，每周注射一次，連續(xù)注射3周，兩周后收取全身肌肉組織及肝、腎臟等。利用與上述相同的檢測(cè)

7、方法，在RNA及蛋白水平上測(cè)試F5對(duì)PMO活性的增強(qiáng)作用，以評(píng)價(jià)F5對(duì)PMO的系統(tǒng)效果。同時(shí)利用組織免疫染色檢測(cè)F5對(duì)肌肉和肝及腎臟是否造成潛在毒副作用。
　　6.在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)新型運(yùn)輸輔助劑F9是通過(guò)提高反義寡核苷酸藥物在組織中的攝取，而增強(qiáng)反義寡核苷酸藥物的活性。為測(cè)試F5是否同樣提高反義寡核苷酸藥物在組織中的攝取而起作用，我們采用 lissamine熒光標(biāo)記 PMO與F5在mdx小鼠上共注射。25 mg/kg lis

8、samine標(biāo)記的PMO與F5通過(guò)尾靜脈注射到成年mdx小鼠中，每天注射一次，連續(xù)注射3天，四天后收取全身組織樣品包括肌肉及肝、腎等非肌肉組織，通過(guò)小動(dòng)物成像，檢測(cè)各組織中 lissamine熒光標(biāo)記的PMO的熒光強(qiáng)度，以確定F5對(duì)PMO在mdx小鼠組織分布變化情況。同時(shí)利用上述提到的RT-PCR和Wetsern Blot方法，檢測(cè)F5對(duì)PMO的作用效果。7.基于上述試驗(yàn)結(jié)果，在mdx小鼠模型上，系統(tǒng)測(cè)試F5對(duì)PMO的長(zhǎng)期作用效果。將5

9、0 mg/kg的PMO與F5通過(guò)尾靜脈注射方式，每周注射1次，連續(xù)注射3次；隨后，每月注射1次，連續(xù)注射5次，最后一次注射后兩周，收取全身組織包括肌肉及肝、腎等。利用IHC、RT-PCR和Western Blot在RNA及蛋白水平上檢測(cè)PMO介導(dǎo)外顯子跳讀和dystrophin蛋白恢復(fù)表達(dá)情況；同時(shí)通過(guò)抓力測(cè)試、dystrophin蛋白復(fù)合物、血清中肌酸激酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)移酶等指標(biāo)檢測(cè)及組化染色等方法，系統(tǒng)評(píng)估F5對(duì)PMO的增強(qiáng)效果和對(duì)m

10、dx小鼠功能改善情況及潛在的毒副作用，以確定F5對(duì)反義寡核苷酸藥物PMO的長(zhǎng)期作用效果。
　　8.為測(cè)試野生型小鼠作為杜興肌肉萎縮癥模型的可行性，我們將6種不同的反義寡核苷酸藥物在正常野生C57BL/6小鼠的脛前肌上進(jìn)行局部注射，在48 h后收取肌肉組織，利用 RT-PCR方法在 RNA水平上檢測(cè)外顯子跳讀效率，并與杜興肌肉萎縮癥模型小鼠模型（mdx）進(jìn)行比較，以確定野生型小鼠C57BL/6作為DMD反義寡核核苷酸藥物活性檢測(cè)模型

11、的可行性。
　　9.在野生型小鼠C57BL/6模型上，測(cè)試反義寡核苷酸藥物PMO、PNA、2’OMe作用的時(shí)間效應(yīng)，以48 h，2-week和4-week作為測(cè)試時(shí)間點(diǎn)，利用RT-PCR方法檢測(cè)外顯子跳讀效率；通過(guò)與 mdx小鼠作用效果比較，以確定在野生型小鼠C57BL/6上檢測(cè)外顯子跳讀的最佳時(shí)間點(diǎn)。
　　10.利用蘇木精-伊紅染色處理組肌肉組織，以確認(rèn)不同反義寡核苷酸藥物在不同時(shí)間點(diǎn)是否對(duì)局部肌肉組織造成損傷。
　

12、　11.將上述三種不同反義寡核苷酸藥物，分別在ICR、C3H及BABL/C小鼠前脛骨肌進(jìn)行局部測(cè)試，48 h收樣，利用RT-PCR測(cè)試不同反義寡核苷酸藥物在不同小鼠模型上的外顯子跳讀效率，以確定其他野生型小鼠作為DMD反義寡核苷酸藥物活性測(cè)試模型的可行性。
　　12.在野生型小鼠C57BL/6和C3H上系統(tǒng)測(cè)試PMO介導(dǎo)外顯子跳讀效率，并與mdx小鼠進(jìn)行比較。通過(guò)低劑量，多次重復(fù)尾靜脈注射（25mg/kg，每周注射1次，連續(xù)注射3

13、次），兩周后收取全身肌肉組織，利用RT-PCR檢測(cè)不同組織中PMO介導(dǎo)的外顯子跳讀效率。與mdx小鼠比較，以確定野生型小鼠作為DMD反義寡核苷酸藥物系統(tǒng)活性測(cè)試模型的可行性。
　　結(jié)果：
　　1.通過(guò)5種不同輔助劑（F4、F5、F9、F10及F12）與MOE在mdx小鼠前脛骨肌中的局部測(cè)試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與生理鹽水相比，5種輔助劑均能提高反義寡核苷酸藥物MOE的外顯子跳讀活性和dystrophin蛋白表達(dá)水平，其中以F5和F12

14、效果最明顯，效率提高分別達(dá)到生理鹽水的3.53及3.45倍。
　　2.通過(guò)對(duì)5種輔助劑（F4、F5、F9、F10及F12）與反義寡核苷酸藥物PNA在mdx小鼠上的局部測(cè)試結(jié)果表明：與生理鹽水相比，5種輔助劑均能提高 PNA外顯子跳讀效率及dystrophin蛋白表達(dá)水平，增強(qiáng)效率在1.27~1.54倍之間；而5種輔助劑之間無(wú)明顯差異。通過(guò)比較同種輔助劑對(duì)不同反義寡核苷酸藥物的增強(qiáng)作用，從而確定F5增強(qiáng)效果最為明顯。
　　3.

15、在 F5與不同反義寡核苷酸藥物局部測(cè)試中，結(jié)果表明：F5不但能顯著提高PMO、PNA和MOE介導(dǎo)外顯子跳讀能力，而且能提高其他不同類反義寡核苷酸藥物包括M12-PMO、B-MSP-PMO和R-PMO的局部外顯子跳讀效率。其中，F(xiàn)5對(duì)PMO增強(qiáng)作用最為明顯，達(dá)到4.24倍。
　　4.對(duì)F5濃度效應(yīng)測(cè)試結(jié)果表明：濃度為5%的F5對(duì)PMO作用效果優(yōu)于其他兩個(gè)測(cè)試濃度包括2.5%和7.5%，進(jìn)一步確認(rèn)濃度為5%的F5為最佳測(cè)試濃度。5.通

16、過(guò)F5與PMO在mdx小鼠上的系統(tǒng)測(cè)試，確認(rèn)F5能顯著提高PMO介導(dǎo)外顯子跳讀和dystrophin蛋白恢復(fù)表達(dá)能力。組織化學(xué)染色結(jié)果未發(fā)現(xiàn)任何藥物相關(guān)的毒副作用。
　　6.在mdx小鼠模型上，進(jìn)一步測(cè)試了F5對(duì)熒光標(biāo)記PMO組織分布和攝取作用。結(jié)果表明：F5能促進(jìn)PMO在各組織中的攝取，尤以肌肉中效果最為明顯，但不改變藥物的組織分布；說(shuō)明F5通過(guò)提高PMO在肌肉組織中的攝取，從而提高PMO介導(dǎo)外顯子跳讀和dystrophin蛋白

17、恢復(fù)表達(dá)能力。
　　7.利用mdx小鼠模型對(duì)F5與PMO的長(zhǎng)期測(cè)試結(jié)果表明：長(zhǎng)期重復(fù)注射PMO與F5能夠介導(dǎo)外顯子跳讀和恢復(fù)dystrophin蛋白表達(dá)，改善mdx小鼠的生理功能和病理狀態(tài)。但與生理鹽水相比，F(xiàn)5未表現(xiàn)出顯著提高作用。相關(guān)的免疫細(xì)胞檢測(cè)及組織病理染色顯示，重復(fù)使用F5未引發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)和藥物相關(guān)毒副作用盡管長(zhǎng)期重復(fù)注射F5和PMO減緩mdx小鼠疾病進(jìn)程，但與生理鹽水相比，沒(méi)有顯著性差異。
　　8.對(duì)6種不同反

18、義寡核苷酸藥物在野生型小鼠C57BL/6上的測(cè)試結(jié)果表明：與mdx小鼠相比，6種不同反義寡核苷酸藥物均能在C57BL/6小鼠上介導(dǎo)水平相近的外顯子跳讀，說(shuō)明野生型小鼠C57BL6可作為DMD反義寡核苷酸藥物活性局部測(cè)試模型。
　　9.在C57BL/6小鼠上對(duì)PMO、PNA和2’OMe時(shí)間效應(yīng)研究結(jié)果表明：不同反義寡核苷酸藥物在不同時(shí)間點(diǎn)介導(dǎo)外顯子跳讀效率不同。PMO和PNA在注射4周后，外顯子跳讀效率最高；而2’OMe在注射兩周后

19、，外顯子跳讀效率高于其他時(shí)間點(diǎn)。整體上，三種反義寡核苷酸藥物在注射后48 h都能檢測(cè)到明顯的跳讀。進(jìn)一步肌肉組織染色結(jié)果顯示：三種反義寡核苷酸藥物在不同時(shí)間點(diǎn)均未導(dǎo)致肌肉組織損傷。
　　10.三種反義寡核苷酸藥物 PMO、PNA和2’OMe在其他野生型小鼠 C3H、BABL/C和ICR上局部測(cè)試結(jié)果表明：與mdx小鼠相比，三種反義寡核苷酸藥物均能在三種不同小鼠模型上介導(dǎo)外顯子跳讀，且在不同小鼠模型介導(dǎo)外顯子跳讀效率相當(dāng)，其中以C5

20、7BL/6和C3H最接近mdx小鼠上的相應(yīng)反義寡核苷酸介導(dǎo)外顯子跳讀水平。
　　11.在野生型小鼠C57BL/6和C3H以及mdx小鼠上對(duì)PMO的系統(tǒng)測(cè)試結(jié)果表明，PMO在不同小鼠模型上介導(dǎo)全身肌肉組織中外顯子跳讀效率不同，其中以C57BL/6小鼠的系統(tǒng)外顯子跳讀效率最接近mdx小鼠。
　　結(jié)論：
　　1.通過(guò)在mdx小鼠上對(duì)5種候選輔助劑（F4、F5、F9、F10和F12）與不同反義寡核苷酸藥物組合篩選，結(jié)果表明:5

21、種輔助劑均能顯著提高不同反義寡核苷酸藥物的活性，但增強(qiáng)幅度有差異，以F5對(duì)PMO作用效果最為明顯。
　　2. F5濃度效應(yīng)試驗(yàn)證明：5%的F5為最適使用濃度，對(duì)反義寡核苷酸藥物增強(qiáng)效果最佳。
　　3.對(duì) F5的系統(tǒng)測(cè)試結(jié)果顯示：短期重復(fù)使用 F5可高效地促進(jìn)反義寡核苷酸藥物的活性，但長(zhǎng)期重復(fù)使用作用效果不明顯。系統(tǒng)測(cè)試結(jié)果表明F5可作為反義寡核苷酸藥物的運(yùn)輸輔助劑，提高反義寡核苷酸藥物在肌肉組織中的生物活性，為其后續(xù)轉(zhuǎn)化應(yīng)用