甘露聚糖結合凝集素誘導U937細胞凋亡機制的初步探索.pdf

1、MBL(mannan-binding lectin,MBL)作為天然免疫的重要分子,其與感染和免疫缺陷疾病之間的聯(lián)系一直是研究的熱點[1-2],也有關于MBL調(diào)節(jié)免疫細胞分化成熟[3-5]和調(diào)節(jié)MΦ/Mo吞噬功能的報道[6]。研究發(fā)現(xiàn),甘露糖結合凝集素(mannose-binding lectin,MBL)能結合Hela細胞表面的甘露糖受體激活下游caspase,通過級聯(lián)反應誘導Hela細胞發(fā)生凋亡[7]。與MBL同屬C型凝集素超家族中

2、膠原凝集素家族成員的肺表面活性物質(zhì)脫輔基蛋白A和D(SP-A和SP-D)與MBL一樣具有抗感染和抵抗各種微生物的功能,SP-A和SP-D能通過Ca2+依賴/非依賴的方式促進MΦ對早期凋亡和/或晚期凋亡細胞的吞噬[8-9]。經(jīng)典途徑重要的補體分子C1q在結構上和MBL亦有許多相似之處,二者均可結合到凋亡細胞表面,促進各種免疫細胞(MΦ,imDCs等)對凋亡細胞的吞噬[10-11],如網(wǎng)鈣蛋白(C1qR)結合CD91介導對整個凋亡細胞和細胞

3、碎片的吞噬,MBL還能以Ca2+依賴的方式結合微生物來源和凋亡細胞來源的DNA和RNA片段,促進吞噬細胞對其內(nèi)吞[12]?？梢?膠原凝集素家族不少成員在細胞凋亡過程和凋亡細胞清除中起著重要作用,本科室王明永博士曾發(fā)現(xiàn)MBL對Jurkat細胞的增殖有抑制作用[13],目前關于MBL,對細胞凋亡影響的研究仍甚少。
　　 在本實驗中,我們首先從人新鮮冰凍血漿中提取獲得較高純度、無LPS且具有生物學活性的天然MBL,然后以人單核細胞系來

4、源的U937細胞為細胞模型,初步研究MBL與U937細胞的結合,MBL對其生長的影響,并對MBL促進U937細胞凋亡的機制進行初步探索。
　　 一.人血漿中MBL的純化分離與LPS去除人血漿中MBL濃度較低,正常人在40～3500μg/ml,平均約900μg/ml[14-15]。MBL的純化取決于其與甘露聚糖的Ca2+依賴性親和力。實驗采用本科室陳月博士和王明永博士建立的配體甘露聚糖-Sepharose4B親和層析柱體系,將預處

5、理人血漿2次上柱親和層析分離,分別用Mannose、EDTA溶液洗脫結合蛋白法純化MBL[16]。
　　 脂多糖(LPS)為革蘭陰性細菌細胞壁的主要成分,大量文獻報道LPS對MΦ/Mo表型的分化和成熟均有重要影響[17-18]。我們以人單核細胞來源的U937細胞為研究對象,LPS的去除是實驗可靠的重要基礎。所以我們通過去內(nèi)毒素凝膠柱去除LPS和與LPS結合的MBL,應用鱟試劑檢測去除效果,結果證明LPS去除前后差異顯著,能夠達到

6、去除目的。為進一步驗證處理后的MBL符合實驗要求,我們對蛋白的生物學活性和免疫學活性進行了鑒定:SDS-PAGE和Westernblot表明,所得MBL為存在大量Mr>200000高聚體形式的MBL,應具有較高活性,配體結合實驗表明所得MBL具有免疫學活性,甘露聚糖結合實驗證明所得MBL具有生物學活性,為后續(xù)實驗提供了可靠的保證。
　　 二.MBL對U937細胞增殖和凋亡的影響近年來,有研究發(fā)現(xiàn)甘露糖結合凝集素(mannose-

7、binding lectin)對Hela細胞有促凋亡的作用。SP-A,SP-D,C1q和MBL通過免疫調(diào)節(jié)作用促進凋亡細胞被吞噬。同時,我們在U937細胞培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)高濃度MBL條件下,細胞增殖出現(xiàn)受抑。根據(jù)膠原凝集素家族各成員之間結構和功能的同源性,我們推測MBL很有可能通過誘導細胞凋亡而抑制其增殖。
　　 首先,我們通過細胞ELISA證實MBL與U937之間能夠相互結合,為后續(xù)的實驗提供了可靠的保證。不同濃度MBL培養(yǎng)細胞

8、后加入CCK-8試劑,37℃培養(yǎng)箱反應2h后檢測A450nm值。同樣的方法處理細胞(時效和量效)后用Hochest33258對細胞核進行染色,觀察細胞的核結構是否完整。運用流式細胞術Annexin V-FICT/PI雙染法(時效和量效)對細胞的早、中晚期凋亡率進行定量。通過DNA ladder電泳鑒定引起細胞死亡的是壞死還是凋亡。
　　 CCK-8結果顯示,30～50μg/ml MBL作用U937細胞72h時,細胞增殖明顯受抑,

9、而低濃度組(10～20μg/ml)無細胞增殖受抑現(xiàn)象,細胞甚至出現(xiàn)劑量依賴性的增殖,我們推測MBL對U937細胞的作用很有可能并不是單一的、單向的。Hoechst33258和Annexin V/PI的結果表明高濃度MBL培養(yǎng)細胞72h,細胞不僅出現(xiàn)了增殖受抑且細胞膜的完整性被破壞,已發(fā)生凋亡:細胞核由染色均一出現(xiàn)染色質(zhì)染色不均、核固縮及核碎裂,細胞凋亡率隨MBL濃度的增加、作用時間的延長而上升。光鏡下,對照組細胞培養(yǎng)54h后大量增殖并出

10、現(xiàn)成團現(xiàn)象,MBL50μg/ml組細胞數(shù)量明顯低于對照組,且狀態(tài)欠佳。通過DNA ladder電泳染色體的片段化確證了引起細胞死亡的是凋亡而非壞死?？傊?30μg/ml～50μg/ml MBL作用于U937細胞72h時能夠促進其凋亡,且具有濃度依賴性,但其機制需要進一步的探討。
　　 三.MBL促進U937細胞凋亡機制的探討細胞凋亡是一種受基因控制的自主性死亡,有賴于新的RNA和蛋白質(zhì)的合成。凋亡有三條途徑:死亡受體途徑、線粒體

11、途徑和CTL介導的顆粒酶途徑。死亡受體途徑通過死亡受體(Fas、TNFR1等)與相應配體(FasL、TNF等)結合能招募FADD;線粒體途徑通過抗凋亡成員(Bcl-2、Bcl-XL)和促凋亡成員(Bax、Bid)調(diào)控線粒體膜對細胞色素C的通透性。二者最終激活Caspase-3而切割胞內(nèi)底物、破壞細胞結構和代謝,導致凋亡的生化和形態(tài)學變化。
　　 為探索MBL導致U937細胞凋亡的可能途徑和機制,我們欲通過Realtime-PCR

12、和WB對參與凋亡過程的各基因和蛋白表達量進行分析。不同濃度MBL(0,30,50μg/ml)培養(yǎng)U937細胞,72h后裂解細胞收集蛋白或提取細胞總RNA,然后通過Western Blot和Real time-PCR對各組蛋白和基因的表達量進行分析。結果顯示,MBL組Fas和Caspase-3基因表達量上升,而Bcl-2和Bax基因表達量無顯著變化,Fas和FasL蛋白表達量上升,凋亡執(zhí)行者Caspase-3被剪切激活,而和參與DNA損傷