金華豬成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)及其生物學(xué)特性研究.pdf

1、金華豬是我國優(yōu)良的地方家畜種質(zhì)資源之一，加強(qiáng)金華豬的保護(hù)對畜牧業(yè)發(fā)展具有重要的意義。成纖維細(xì)胞系的建立使金華豬種質(zhì)資源在細(xì)胞水平上得以保護(hù)，一方面為畜禽資源的保護(hù)提供新的途徑，另一方面為細(xì)胞生物學(xué)、胚胎克隆以及轉(zhuǎn)基因研究提供必要的研究材料。此外，本成纖維細(xì)胞系的成功建立可以為以后其它種質(zhì)資源在細(xì)胞水平上的保存提供理論與技術(shù)支持。
　　 研究以40日齡金華豬胎兒為試驗材料，采用組織貼壁法建立了金華豬胎兒成纖維細(xì)胞系，并對所建細(xì)胞系

2、進(jìn)行了形態(tài)學(xué)、生長動力學(xué)、細(xì)胞活力、染色體、同工酶、微生物污染、細(xì)胞凋亡、pEGFP-N3基因轉(zhuǎn)染等生物學(xué)特性研究。
　　 經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)所培養(yǎng)細(xì)胞呈長梭形即典型的成纖維細(xì)胞狀;原代細(xì)胞生長迅速，貼壁后2-3d可長滿培養(yǎng)瓶，獲得的成纖維細(xì)胞生長態(tài)勢良好;細(xì)胞生長曲線呈典型的“S”形，與其它成纖維細(xì)胞的生長趨勢相同;細(xì)胞的細(xì)菌、霉菌和支原體三項微生物檢測均為陰性，表明培養(yǎng)細(xì)胞未受到上述三種微生物的污染。
　　 細(xì)胞凍存前

3、后檢測發(fā)現(xiàn)金華豬胎兒成纖維細(xì)胞凍存前及復(fù)蘇后細(xì)胞的活率分別為95.2％、92.8％，復(fù)蘇后細(xì)胞活率有所下降，主要原因是凍存復(fù)蘇時遭受化學(xué)與機(jī)械損傷所致。在對培養(yǎng)細(xì)胞凍存過程中以未凍存細(xì)胞為對照組探討了兩次凍存對細(xì)胞凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)凍存復(fù)蘇后細(xì)胞的凋亡程度會升高，第一次凍存后細(xì)胞凋亡程度大于未凍存細(xì)胞，第二次凍存細(xì)胞的凋亡程度又明顯的高于第一次凍存細(xì)胞。
　　 通過試驗表明秋水仙素濃度及作用時間是影響制作細(xì)胞染色體標(biāo)本成功與否的關(guān)

4、鍵因素，在本研究中當(dāng)秋水仙素濃度為0.4μg/ml作用細(xì)胞6h后得到的染色體標(biāo)本效果較好。染色體標(biāo)本分析表明，成纖維細(xì)胞染色體數(shù)2n=38，并且2n=38所占的比例為91％，達(dá)到了建系的要求;用低離子強(qiáng)度聚丙烯酰胺凝膠電泳法成功分離細(xì)胞的LDH及MDH同工酶，經(jīng)酶譜分析表明所培養(yǎng)的細(xì)胞沒有受到其它細(xì)胞的污染。
　　 對金華豬胎兒成纖維15代細(xì)胞凋亡率進(jìn)行檢測，結(jié)果僅為2％，說明細(xì)胞沒有大規(guī)模的凋亡發(fā)生。用脂質(zhì)體介導(dǎo)綠色熒光蛋白基