工業(yè)釀酒酵母代謝工程改造強化S-腺苷-蛋氨酸生物合成的研究.pdf

1、S-腺苷蛋氨酸(SAM)廣泛存在于生物體細(xì)胞中，參與體內(nèi)轉(zhuǎn)甲基、轉(zhuǎn)硫基和聚胺合成等多種重要的反應(yīng)，它在肝病、抑郁癥和關(guān)節(jié)炎等疾病的治療與預(yù)防中有重要的應(yīng)用，市場需求量巨大。本文運用代謝工程技術(shù)對釀酒酵母工業(yè)菌株ZJU001中SAM合成的相關(guān)代謝途徑進(jìn)行改造以提高SAM的產(chǎn)量。
　　在菌株ZJU001中利用多拷貝整合型質(zhì)粒pYMIKP-SAM2實現(xiàn)了SAM2基因的過表達(dá)，增加了胞內(nèi)SAM合成酶的表達(dá)量，提高菌株合成SAM的能力。在1

2、0L發(fā)酵罐上，改造菌株的SAM產(chǎn)量達(dá)到8.81g/L，比原始菌株提高了27.1％。
　　以模式菌株BY4741為對象開展了釀酒酵母胞內(nèi)合成SAM相關(guān)代謝網(wǎng)絡(luò)的研究。從SAM合成的底物供給、SAM合成后的累積及降解途徑等角度出發(fā)，分別構(gòu)建了P型ATP酶基因PMR1、糖原支鏈酶基因GLC3、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶基因PHO85和SAM脫羧酶基因SPE2等四個基因敲除的突變菌株?？疾旄魍蛔兙闟AM的合成能力，發(fā)現(xiàn)GLC3和SPE2的單

3、獨缺失有利于釀酒酵母對SAM的合成與積累。
　　為提高工業(yè)菌株ZJU001中基因敲除的穩(wěn)定性，建立了一套針對雙倍體工業(yè)菌株的基因快速敲除的新方法。構(gòu)建了ZJU001中的GLC3、SPE2、ERG4和ERG6四個基因分別敲除及GAL11基因過表達(dá)的五個突變菌株。通過考察突變菌株的SAM合成能力，結(jié)果顯示GLC3和SPE2基因敲除的突變菌株其SAM產(chǎn)量分別提高了20.1％和12.4％。
　　運用標(biāo)記回收的基因敲除技術(shù)在ZJU00

4、1中同時敲除GLC3和SPE2，并過表達(dá)SAM2，獲得工程菌ZJU001-GS-SAM2。該菌在搖瓶發(fā)酵中的SAM產(chǎn)量達(dá)到1.14g/L，是出發(fā)菌株的1.7倍，結(jié)果表明三個基因改造對促進(jìn)SAM的合成和積累具有協(xié)同作用。
　　運用反饋控制分批補料發(fā)酵策略在10L罐上考察了ZJU001-glc3、ZJU001-spe2、ZJU001-GS以及ZJU001-GS-SAM2的SAM生產(chǎn)能力，結(jié)果顯示ZJU001-GS-SAM2的SAM產(chǎn)量