華東地區(qū)鴨圓環(huán)病毒感染流行病學(xué)調(diào)查及其單克隆抗體的制備.pdf

1、圓環(huán)病毒是多種動(dòng)物都感染的重要病原,主要侵害免疫系統(tǒng),給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)很大損失,引起了世界廣泛關(guān)注。鴨圓環(huán)病毒(DuCV)于2003年由德國(guó)學(xué)者Hattermann首次報(bào),是迄今發(fā)現(xiàn)感染鴨的最小病毒,屬圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬成員,無(wú)囊膜,球形或20面體對(duì)稱(chēng),直徑在15 nm左右,基因組為環(huán)狀單股DNA,有兩個(gè)主要的閱讀框,ORFV1編碼Rep蛋白,ORFC1編碼Cap蛋白.由于目前對(duì)其研究較少,其致病特點(diǎn)與機(jī)理目前還不清楚。但國(guó)內(nèi)外先后對(duì)其流

2、行情況進(jìn)行了多次報(bào)道,由此可見(jiàn),鴨群的鴨圓環(huán)病毒感染流行已經(jīng)相當(dāng)普遍,應(yīng)該引起足夠的重視。
　　 Cap蛋白是圓環(huán)病毒產(chǎn)生保護(hù)性抗體的主要抗原區(qū)域,具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值,為了表達(dá)鴨圓環(huán)病毒的全長(zhǎng)Cap蛋白,本研究以從華東地區(qū)采集的鴨法氏囊樣品中提取病毒基因組作為模板,設(shè)計(jì)引物,通過(guò)PCR方法擴(kuò)增DuCV全長(zhǎng)cap基因序列(774 bp),并與pET32a(+)載體相連,原核表達(dá)了DuCV重組Cap蛋白.而之前文獻(xiàn)報(bào)道圓環(huán)病毒全長(zhǎng)C

3、ap蛋白不能原核表達(dá),Shao-Ning Liu將N端前36個(gè)氨基酸去掉表達(dá)了截短的DuCV-Cap蛋白,而本研究成功的表達(dá)了全長(zhǎng)Cap蛋白,抗原區(qū)域比截短的Cap蛋白更長(zhǎng),因此抗原性可能也會(huì)更好。
　　 目前尚無(wú)診斷鴨圓環(huán)病毒抗體的商品化ELISA試劑盒,為了對(duì)華東地區(qū)DuCV血清流行病學(xué)情況進(jìn)行調(diào)查,本試驗(yàn)以純化后的重組Cap蛋白作為抗原,通過(guò)優(yōu)化各步反應(yīng)條件,建立了檢測(cè)DuCV抗體的間接ELISA方法。最終確定最佳抗原包被

4、濃度為12.5μg/ml,鴨血清最佳稀釋倍數(shù)為1:80；判斷標(biāo)準(zhǔn)為樣品OD值≥0.40判定為陽(yáng)性,OD值<0.40判定為陰性,通過(guò)試驗(yàn)證明該方法具有良好的特異性、敏感性和重復(fù)性。用此方法對(duì)從華東地區(qū)收集的19個(gè)鴨群(日齡不同,共四個(gè)品種)的321份血清樣品進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果為DuCV抗體總陽(yáng)性率為45.8％,其中江蘇地區(qū)為26.7％,山東地區(qū)為60.9％,對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)隨著日齡的增加,DuCV抗體陽(yáng)性率也隨之增加；不同品種DuCV感

5、染情況也不同,說(shuō)明DuCV感染可能與鴨的品種有關(guān)。
　　 鴨是禽流感病毒的主要宿主,也是其重要傳播媒介,因此禽流感疫苗免疫對(duì)鴨群至關(guān)重要,而臨床上經(jīng)常出現(xiàn)鴨群接種禽流感疫苗后抗體產(chǎn)生不穩(wěn)定的現(xiàn)象,為了揭示這一現(xiàn)象產(chǎn)生的可能原因,對(duì)上述同一批血清樣品進(jìn)行禽流感(H5和H9)抗體滴度測(cè)定,然后對(duì)禽流感疫苗免疫后抗體滴度不合格樣品與DuCV感染的關(guān)系進(jìn)行統(tǒng)計(jì)(禽流感不合格樣品在DuCV陽(yáng)樣品中所占比例vs.禽流感不合格樣品在DuCV陰

6、性樣品所占的比例)得:禽流感H5亞型抗體檢測(cè)結(jié)果為山東地區(qū)(16.7％vs.9.8％),江蘇地區(qū)(57％vs.36.3％)；禽流感H9亞型抗體檢測(cè)結(jié)果為山東地區(qū)(47.2％vs.19.7％),江蘇地區(qū)(75％vs.69％).由此可知禽流感抗體不合格樣品在DuCV陽(yáng)性樣品中所占比例均高于其在DuCV陰性樣品中所占的比例,而且差異極顯著。這表明DuCV的感染抑制了免疫后正?？贵w的產(chǎn)生,從而為闡明鴨圓環(huán)病毒感染造成的危害提供了依據(jù)。
　

7、　 為了對(duì)DuCV進(jìn)一步的研究,還進(jìn)行了其單克隆抗體的制備,以純化的原核表達(dá)重組Cap蛋白作為免疫原,按常規(guī)方法免疫BALB/c小鼠,取其脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合,融合率為100％,經(jīng)間接ELISA方法篩選獲得了3株能穩(wěn)定分泌抗DuCV-Cap蛋白的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞,并分別命名為1G5811,2E6C1和3E9C7,間接ELISA檢測(cè)其細(xì)胞上清效價(jià)分別為1:1024,1:512,1:1024；腹水效價(jià)均大于105。經(jīng)單抗亞類(lèi)試