腎移植受者PD-1-PD-L1信號通路在基礎(chǔ)和臨床研究.pdf

1、背景：負性調(diào)控共刺激分子PD-1(programmed death-1)為T、B淋巴細胞表面受體,屬于免疫球蛋白超家族Ⅰ型跨膜糖蛋白,生理條件下在淋巴細胞表面少量表達,在T、B細胞抗原受體激發(fā)后呈誘導性表達。PD-1與其兩個配體PD-L1和PD-L2結(jié)合,在免疫應(yīng)答中起著負性調(diào)控作用。關(guān)于PD-1/PD-L信號通路與臨床疾病的關(guān)系,如自身免疫性疾病、腫瘤、病毒感染、移植等,其表現(xiàn)的免疫調(diào)節(jié)作用受到越來越多的關(guān)注。
　　 目的：本

2、課題通過對比腎移植術(shù)前術(shù)后與健康對照者外周血單個核細胞表面PD-1的表達,了解PD-1與器官移植耐受的相關(guān)性；以及進一步探討腎移植術(shù)后發(fā)生急性排斥反應(yīng)時檢測PD-1mRNA的表達能否其作為器官移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)預(yù)警；同時探討PD-1分子在器官移植患者外周血淋巴細胞上的表達與循環(huán)中CD4+CD25highTreg的相關(guān)性,從而進一步研究其誘導免疫耐受的機制。
　　 方法：應(yīng)用實時定量RT-PCR技術(shù)和流式細胞學技術(shù)分別檢測PD-

3、1在健康對照者組和腎移植受者術(shù)前術(shù)后外周血上表達情況；應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測PD-1mRNA在腎移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)受者外周血的表達,免疫組化方法用來進一步鑒定PD-1的表達；應(yīng)用單向混合淋巴細胞培養(yǎng)和流式細胞學檢測進一步探討PD-1通路和CD4+CD25highTreg細胞的相關(guān)性從而研究其誘導免疫耐受的機制；應(yīng)用SPSS16統(tǒng)計軟件統(tǒng)計臨床及實驗數(shù)據(jù)。
　　 結(jié)果：實時定量RT-PCR檢測健康對照組、腎移植d0組、腎移植后

4、d28組PD-1mRNA相對表達量,使用Kruskal-Wallis法秩和檢驗法,健康對照組1.5±1.101,腎移植d0組4.221±1.106,腎移植后d28組9.633±2.101,三組間兩兩比較P<0.01,差異有統(tǒng)計學意義。PD-1的表達隨病程階段呈現(xiàn)先降低后增高的趨勢,流式細胞學檢測PD-1+CD3+Tcell百分比呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢。應(yīng)用Kruskal-Wallis檢驗,三組外周血中PD-1mRNA的相對表達量發(fā)現(xiàn)急性

5、排斥反應(yīng)受者外周血PD-1mRNA顯著高于腎功能穩(wěn)定者,P<0.01.三組中位數(shù)值分別為4.52±1.1,1.12±0.6,0.7±0.4。PD-1mRNA的相對表達量與急性排斥反應(yīng)患者血清肌酐呈正比關(guān)系。使用Spearman's相關(guān)檢驗(r=0.81,P=0.03),在急性排斥反應(yīng)患者組發(fā)現(xiàn)了PD-1mRNA和血清肌酐的顯著相關(guān)性Spearman's相關(guān)檢驗(r=0.81,P=0.03)。而移植腎功能延遲恢復(fù)受者(r=0.02,P=0

6、.73)、移植腎功能穩(wěn)定受者(r=0.06,P=0.58)不具有這種相關(guān)性。急性排斥反應(yīng)發(fā)生時PD-1mRNA表達與急性排斥反應(yīng)的嚴重性呈正相關(guān)。使用Spearman's相關(guān)檢驗,我們觀察到在急性排斥反應(yīng)患者組PD-1mRNA的相對表達量和從腎移植手術(shù)到發(fā)生急性排斥反應(yīng)時間的顯著相關(guān)性(r=0.71,P=0.04)。同時我們用免疫組化的方法證實了急性排斥反應(yīng)時浸潤淋巴細胞表面大量PD-1的表達。三組均顯CD4+CD25+Treg表面PD

7、-1的表達比CD4+CD25-Treg表面PD-1的表達高,具有統(tǒng)計學差異；而三組之間比較發(fā)現(xiàn),急排組PD-1的表達水平和CD4+CD25highTreg最高,具有統(tǒng)計學差異。單向混合淋巴細胞培養(yǎng)后檢測到逐漸減少的CD4+CD25+Treg數(shù)量,分別為19.1％(處理組)、27.4％(對照組),而CD69在受抑制的CD4+CD25-細胞上的表達增加,分別為41.2％(處理組)、25.1％(對照組)。這些結(jié)果說明在急性排斥反應(yīng)患者外周血P

8、BMC的體外實驗中,PD-1通路的抑制可能調(diào)節(jié)CD4+CD25+Treg細胞的功能,從而導致被CD4+CD25+Treg細胞抑制的T細胞的激活。
　　 結(jié)論：PD-1在健康人群中可有表達,腎移植術(shù)前組、腎移植術(shù)后組明顯高于健康對照組,具有顯著統(tǒng)計學差異,并且腎移植術(shù)后不同時間點PD-1mRNA呈先降低后升高的趨勢,PD-1+CD3+T細胞比例呈現(xiàn)先降低后增高的趨勢；腎移植術(shù)后早期PD-1mRNA表達升高可以作為排斥反應(yīng)的預(yù)警信號

9、指導臨床治療,同時患者PD-1表達與急性排斥反應(yīng)嚴重程度呈正比,和發(fā)生急性排斥反應(yīng)的時間呈反比,免疫組化結(jié)果再次證實了急性排斥反應(yīng)時淋巴細胞表面大量的PD-1分子的表達；在急性排斥反應(yīng)發(fā)生時外周血CD4+CD25highTreg數(shù)量增加,而使用抗PD-L1單克隆抗體抑制PD-1通路后CD4+CD25highTreg數(shù)量明顯降低,而CD69作為T細胞活化信號在CD4+CD25-T細胞表面增加,說明了PD-1通路參與了腎移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)