鮑曼不動桿菌外膜蛋白A1S-0115A的克隆、表達及免疫保護性研究.pdf

1、鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumannii，Ab)是一種革蘭陰性非發(fā)酵桿菌，廣泛分布于水和土壤、醫(yī)院環(huán)境、人體腔道及皮膚表面，為院內(nèi)感染菌中，檢出率僅次于銅綠假單胞菌的條件致病菌。鮑曼不動桿菌對常規(guī)消毒處理具有較強的抵抗力，紫外線和一般消毒劑僅能抑制其生長，不能將其殺滅[1]，因此，鮑曼不動桿菌常藏匿于各種醫(yī)療器械及醫(yī)院病房角落，對于重癥患者，如老年患者、危重疾病及機體抵抗力弱的患者，以及使用各種侵入性操作和長期使用廣

2、譜抗生素治療的患者來說，鮑曼不動桿菌可成為重要的致病菌[2-4]。隨著廣譜抗生素、激素、免疫抑制劑及各種侵入性治療的的廣泛應(yīng)用，在抗生素篩選壓力下，近年來在國內(nèi)外出現(xiàn)了多重耐藥(Multi-DrugResistance)，甚至泛耐藥(Pan-Drug Resistance)鮑曼不動桿菌。泛耐藥鮑曼不動桿菌（Pan-Drug Resistance Acinetobacter baumanii）對FDA推薦的所有用于治療Ab感染的抗生素耐藥

3、，包括頭孢菌素類、碳青霉烯類、beta-內(nèi)酰胺酶抑制劑、氟喹諾酮類和氨基糖苷類。鮑曼不動桿菌幾乎能夠入侵人體的各個器官和系統(tǒng)，引起醫(yī)院獲得性肺炎、泌尿生殖系統(tǒng)感染、傷口及皮膚感染、化膿性關(guān)節(jié)炎、骨髓炎、腹膜炎，嚴重時引發(fā)嚴重敗血癥甚至死亡[5-6]，直接威脅國人的身體健康和公共衛(wèi)生安全。
　　加強對鮑曼不動桿菌感染的防治研究已迫在眉睫，研制安全、有效的新型鮑曼不動桿菌疫苗將對有效控制鮑曼不動桿菌耐藥性蔓延和臨床鮑曼不動桿菌廣泛感染

4、具有重大應(yīng)用價值。針對目前鮑曼不動桿菌臨床上耐藥性急劇上升的狀況，利用鮑曼不動桿菌的免疫原性，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生有效的抗鮑曼不動桿菌免疫反應(yīng)，是防治鮑曼不動桿菌感染的一個新策略。目前針尚未有上市的或進入臨床實驗的鮑曼不動桿菌疫苗的研究，但是實驗室研究已經(jīng)取得一些令人鼓舞的結(jié)果剛處于起步階段，如滅活的全菌疫苗[7-8]，外膜蛋白A（OmpA，最初稱為Omp38）[9-10]，外膜復(fù)合物[11]，外膜小泡[12]，生物膜相關(guān)蛋白[13]等疫苗均顯

5、示具有較好的免疫原性，可有效誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫反應(yīng)。然而目前的研究采用的全菌滅活疫苗及外膜復(fù)合物等，其成分比較復(fù)雜，可能含有效的保護性抗原成分，也可能存在與免疫保護無關(guān)或者副作用的成分，且制備過程難以標準化，而基因工程亞單位疫苗抗原成分明確，效果明確，副作用小，安全性高，是一種理想的疫苗形式。
　　鮑曼不動桿菌感染致病存在多個環(huán)節(jié)，包括細菌的粘附，定植以及毒力因子釋放等環(huán)節(jié)。因此，理想的鮑曼不動桿菌疫苗應(yīng)含有分泌性毒素抗原或定植粘附

6、相關(guān)的蛋白，并且暴露于細菌表面，可以被免疫系統(tǒng)有效的識別，能夠有效刺激宿主產(chǎn)生保護性抗體，以發(fā)揮其調(diào)理吞噬或中和毒素的作用，保護宿主免于鮑曼不動桿菌感染。此外，在制備抗原時，應(yīng)去除蛋白與免疫原性無關(guān)的冗余成分，降低機體的毒副反應(yīng)。因此，篩選鑒定有效的保護性抗原，是成功研制鮑曼不動桿菌基因工程疫苗的前提和關(guān)鍵。
　　研究目的:
　　課題組前期通過反向疫苗學(xué)策略及生物信息學(xué)分析，從鮑曼不動桿菌全基因組中篩選到了多個具有潛在免疫優(yōu)

7、勢的疫苗候選抗原。其中，A1S_0115為鮑曼不動桿菌一個功能未知的外膜蛋白，且具有良好的保守性和特異性，為了實驗研究該蛋白的免疫原性及免疫保護性，探討該蛋白作為鮑曼不動桿菌疫苗候選抗原的可能性，本研究通過基因克隆及表達鮑曼不動桿菌A1S_0115蛋白胞外區(qū)(A1S_0115A)活性片段作為疫苗的候選抗原，評價該抗原在小鼠全身鮑曼不動桿菌感染動物模型中的免疫保護作用，同時對該候選抗原誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫保護的作用機制進行了初步研究。以期為新型、

8、有效的鮑曼不動桿菌基因工程疫苗的分子設(shè)計，抗原選擇，以及后續(xù)的重組亞單位疫苗研究奠定實驗基礎(chǔ)與理論指導(dǎo)。
　　研究方法:
　　1.從鮑曼不動桿菌國際標準株ATCC17978中提取細菌基因組作為PCR的模板，經(jīng)生物信息學(xué)分析后，通過PCR擴增鮑曼不動桿菌A1S_0115胞外區(qū)活性片段（命名為:A1S_0115A），同時引入酶切位點BamHⅠ與NotⅠ。目的基因雙酶切后的回收產(chǎn)物與pGEX-6P-2表達載體相連，轉(zhuǎn)化到Esche

9、richia coli XL-1 blue菌株，在IPTG的誘導(dǎo)下表達GST融合蛋白，經(jīng)GST親和填料初純、柱層析精純及去內(nèi)毒素后，檢測蛋白終產(chǎn)物的純度并進行SDS-PAGE電泳分析。
　　2.為評價候選疫苗抗原A1S_0115A的免疫原性，采用ELISA在免疫后的不同時間點檢測了候選疫苗抗原誘導(dǎo)產(chǎn)生的特異性抗體水平及其亞型，并繪制抗體消長曲線。
　　3.為評價候選疫苗抗原A1S_0115A的免疫保護作用，在通過腹腔感染鮑曼

10、不動桿菌標準株ATCC17978，建立BALB/c小鼠膿毒血癥動物模型基礎(chǔ)上，將候選疫苗抗原A1S_0115A與Al(OH)3佐劑吸附后免疫BALB/c小鼠，并用組氨酸疫苗稀釋液及Al(OH)3佐劑作為空白對照及佐劑對照。小鼠在末次免疫后兩周，用LD80劑量的鮑曼不動桿菌17978菌株(4.2×108CFU)感染小鼠，在細菌攻毒后的7天監(jiān)測小鼠的死亡情況，并計算免疫保護率，同時監(jiān)測感染后各臟器的細菌定植量與病理損傷。
　　4.為初

11、步研究候選疫苗抗原A1S_0115A的免疫保護作用機制，體外檢測了特異性抗體介導(dǎo)的調(diào)理吞噬殺菌作用，體內(nèi)評價A1S_0115A特異性抗體的被動免疫保護效果。同時檢測了免疫小鼠在感染鮑曼不動桿菌后血清中的促炎因子(IL-1β、GM-CSF)及脾細胞中細胞因子(IFN-Υ，IL-4)的表達水平。
　　研究結(jié)果:
　　1.成功構(gòu)建基因工程菌pGEX-6P-2-A1S_0115A/XL-1blue，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，候選疫苗蛋白A1

12、S_0115A以可溶形式表達在工程菌胞周質(zhì)中，經(jīng)GST親和填料初純、柱層析精純及去內(nèi)毒素后，目的蛋白純度高于95％，SDS-PAGE分析其蛋白分子量與預(yù)期大小一致。
　　2.候選疫苗抗原A1S_0115A以D0、D7、D14的免疫程序免疫BALB/c小鼠后，小鼠產(chǎn)生了特異的的體液免疫應(yīng)答反應(yīng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體效價為1∶256000，特異性抗體亞型主要以IgG1為主。在末次免疫后3個月的檢測時間內(nèi)，A1S_0115A特異性抗體水平逐步

13、上升并保持穩(wěn)定，具有相對良好的免疫持久性。
　　3.采用已建立的鮑曼不動桿菌感染BALB/c小鼠的膿毒血癥動物模型，將A1S_0115A候選疫苗免疫小鼠后，LD80致死劑量的鮑曼不動桿菌進行攻毒感染，與佐劑對照組和空白對照組相比，免疫組小鼠的生存率明顯提高，其保護率存在顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(p＜0.05);各臟器的細菌定植量檢測與病理損傷結(jié)果表明，疫苗能顯著減少感染細菌在脾臟，腎臟，心臟，肝臟，肺臟中的定植，同時免疫組小鼠的病理損傷和

14、組織炎癥浸潤亦低于對照組，免疫組小鼠的臨床評分明顯高于各對照組。
　　4.體內(nèi)外的抗體活性及功能檢測結(jié)果表明:純化的特異性A1S_0115A抗體在體外對鮑曼不動桿菌具有明顯的調(diào)理吞噬殺菌作用，在體內(nèi)對鮑曼不動桿菌的感染具有良好的被動免疫保護效果。免疫小鼠在感染鮑曼不動桿菌后的細胞因子檢測結(jié)果表明:疫苗組脾細胞的IFN-Υ及IL-4表達水平明顯高于各對照組(p＜0.05)，而血清中的促炎因子IL-1β及GM-CSF表達水平，疫苗組較

15、各對照組相比則顯著降低(p＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.成功構(gòu)建pGEX-6P-2-A1S_0115A/XL-1 blue基因工程菌，并表達制備了高純度的鮑曼不動桿菌候選疫苗抗原A1S0115A。該抗原免疫小鼠后誘導(dǎo)機體產(chǎn)生了高效價的保護性抗體，對于致死劑量的鮑曼不動桿菌感染具有良好的免疫保護作用。表明該候選抗原具有良好的免疫原性及免疫保護性。
　　2.初步的免疫保護作用機制研究結(jié)果表明:該候選疫苗抗原免疫后可刺