菜籽抗氧化肽的制備、抗氧化機(jī)理及其穩(wěn)定性研究.pdf

1、油菜籽是我國(guó)重要的食用植物油原料之一，其加工副產(chǎn)物菜籽餅粕富含蛋白質(zhì)，是寶貴的植物蛋白資源。小分子菜籽多肽在抗氧化、抗腫瘤、降血壓、增強(qiáng)免疫活性和抑菌等方面具有較強(qiáng)的功能活性，在食品加工等領(lǐng)域具有廣闊的開發(fā)前景。本研究先從菜籽粕中制得菜籽蛋白，再用Alcalase2.4L蛋白酶水解得到菜籽蛋白水解物（RPHs）；利用超濾、葡聚糖凝膠（Sephadex G-15）和半制備液相色譜法（HPLC）純化菜籽蛋白水解物（RPHs）后，以抗氧化能力

2、指數(shù)（ORAC）、細(xì)胞抗氧化實(shí)驗(yàn)兩種方法測(cè)定了RPHs及經(jīng)逐級(jí)分離純化所得到的各菜籽肽組分的抗氧化活性；將基質(zhì)輔助的激光解析電離飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（MALDI-TOF/TOF-MS/MS）和電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜（ESI-MS/MS）相結(jié)合分析了抗氧化活性最高的菜籽肽組分可能的氨基酸序列；進(jìn)一步研究了氧化損傷的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）存活率及細(xì)胞形態(tài)的變化，結(jié)合Western blot檢測(cè)血管內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)調(diào)亡蛋白Caspase-3、Ba

3、x、Bcl-2在H2O2氧化損傷以及菜籽抗氧化肽保護(hù)過(guò)程中的表達(dá)變化，以此研究和探討菜籽抗氧化肽對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的抗氧化保護(hù)機(jī)制；考察了溫度、酸堿度、食品配料成分、金屬離子、防腐劑和人工胃腸液等環(huán)境因素對(duì)菜籽抗氧化肽穩(wěn)定性的影響，提出了穩(wěn)定性的條件。主要研究為：
　　1.菜籽抗氧化肽的制備、分離純化及抗氧化活性分析
　　以抗氧化能力指數(shù)（ORAC）和細(xì)胞內(nèi)抗氧化能力（CAA）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，結(jié)合采用超濾膜分離、Sephadex G

4、-15柱層析及RP-HPLC對(duì)Alcalase2.4L蛋白酶水解得到的菜籽蛋白水解物（RPHs）進(jìn)行逐級(jí)分離純化，結(jié)果顯示經(jīng)一系列分離純化得到的菜籽肽組分RPH-P4-S3-R1表現(xiàn)出最強(qiáng)的抗氧化能力,其ORAC值為2397.95±55.38μM TE/g sample，CAA值為157.07±6.73μmol QE/g sample，EC50值44.74±5.14μg/mL。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)RPH-P4-S3-R1顯示出了良好的抗氧化能力，且

5、逐級(jí)分離后產(chǎn)物的活性明顯提高，這表明分離純化過(guò)程是有效的。
　　2.菜籽抗氧化肽的氨基酸序列分析
　　分析型RP-HPLC檢測(cè)顯示菜籽抗氧化肽RPH-P4-S3-R1和RPH-P4-S3-R3為單一組分峰，表明其可能只含有一個(gè)目標(biāo)肽段。經(jīng)由MALDI-TOF/TOF MS/MS和ESI-MS/MS分析菜籽抗氧化肽RPH-P4-S3-R1和RPH-P4-S3-R3可能的氨基酸序列分別為YWDHNNPQIR(1341.5389D

6、a)和WDHHAPQLR(1158.6195Da)。合成抗氧化肽WDHHAPQLR表現(xiàn)出較好的抗氧化活性，其ORAC值為1596.82±37.25μM TE/g sample，DPPH自由基清除率的IC50值為0.91mg/mL。
　　3.菜籽抗氧化肽（RPH-P4-S3-R3）抗氧化機(jī)理初探
　　本研究采用過(guò)氧化氫（H2O2）誘導(dǎo)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）損傷，建立HUVEC氧化損傷模型，觀察菜籽抗氧化肽（RPH-

7、P4-S3-R3）對(duì)氧化損傷HUVEC的保護(hù)作用，并探討其機(jī)制。體外建模結(jié)果顯示，最佳的H2O2作用濃度為200μmol/L，最佳作用時(shí)間為24h；菜籽抗氧化肽在0.1-0.5mg/mL的濃度范圍內(nèi)對(duì)氧化損傷的HUVEC都具有保護(hù)作用，且最佳作用時(shí)間為24-36小時(shí)；倒置顯微鏡觀察表明菜籽抗氧化肽保護(hù)組的細(xì)胞存活率顯著高于氧化損傷組，且細(xì)胞形態(tài)更正常、完整；Western blot免疫印跡結(jié)果顯示菜籽抗氧化肽保護(hù)組細(xì)胞Caspase-3

8、、Bax蛋白表達(dá)水平高于正常對(duì)照組而明顯低于H2O2損傷模型組（200μmol/L），抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)相比于H2O2損傷模型組也有明顯的增加。這表明菜籽抗氧化肽可以通過(guò)清除體內(nèi)細(xì)胞中過(guò)量的自由基，從而下調(diào)Caspase-3、Bax等凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，抑制HUVEC細(xì)胞的凋亡，起到抗氧化損傷的保護(hù)作用。
　　4.菜籽抗氧化肽的穩(wěn)定性研究
　　以DPPH·自由基清除活性、Fe2+-螯合

9、金屬離子能力為指標(biāo)來(lái)考察溫度、酸堿度、食品配料成分、金屬離子、防腐劑和人工胃腸液等環(huán)境因素對(duì)菜籽抗氧化肽（RPH-P4-S3-R3）穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明：隨著溫度的升高，抗氧化肽的活性逐漸降低，但還是保持在較高水平，但是當(dāng)溫度高于60℃時(shí)，菜籽抗氧化肽的活性顯著降低，溫度為100℃時(shí)，F(xiàn)e2+-螯合金屬離子能力活性保持率僅在30％左右。強(qiáng)酸和強(qiáng)堿環(huán)境對(duì)抗氧化肽的穩(wěn)定性影響較大，當(dāng)溶液的pH值在6.0~8.0范圍內(nèi)時(shí)，活性較為穩(wěn)定?？寡?/p>

10、化肽溶液的活性隨著食鹽濃度的增大而有所降低，當(dāng)食鹽的濃度達(dá)到8%時(shí)，抗氧化肽的活性保持率為86.33%。蔗糖含量在2%-8%范圍內(nèi)時(shí)，菜籽抗氧化肽的活性隨蔗糖含量的增加而顯著下降，在蔗糖含量達(dá)到8%，活性保持率在80%以上。在0.02%-0.16%質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，檸檬酸對(duì)菜籽抗氧化肽的活性影響不大，其活性保持率均在90%以上。常見的金屬離子對(duì)菜籽抗氧化肽的穩(wěn)定性影響不一，Cu2+和Zn+對(duì)菜籽抗氧化肽的DPPH·自由基清除活性和亞鐵離子