藍圓鲹蛋白制備抗氧化肽的研究.pdf

1、藍圓鲹(Decapterus maruadsi)屬于鱸形目鲹科圓鲹屬的一種,是我國重要的經(jīng)濟魚類之一。對其加工利用制成魚糜罐頭制品或改性制備功能活性肽,則可大大提高其附加值。本文以藍圓鲹蛋白為原料,運用酶解技術制備抗氧化肽,采用體外評價法測定其抗氧化活性,通過多種分離技術手段對藍圓鲹多肽進行分級分離,并采用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜對目標肽段進行一級氨基酸序列鑒定。新發(fā)現(xiàn)的肽段經(jīng)化學合成后,對其進行體外抗氧化活性驗證及反應動力

2、學研究。最后研究了藍圓鲹多肽在加工儲藏過程中,及體外模擬胃腸消化道過程中的抗氧化活性穩(wěn)定性,并探討了藍圓鲹多肽與其他常見抗氧化劑的協(xié)同抗氧化效應。主要研究結(jié)果如下:
　　(1)通過凱氏定氮法、索氏抽提法和OPA柱前衍生化高效液相色譜法分別測定藍圓鲹蛋白的基本組分含量。結(jié)果表明藍圓鲹是一種高蛋白(80.16％)、低脂肪(10.38%)、必需氨基酸含量(46.28g/100g protein)和抗氧化性氨基酸含量(32.59g/100

3、g protein)均較理想的食品原料。在此基礎上運用蛋白酶解技術,以DPPH·清除活性、O2·清除活性及還原能力三種體外抗氧化能力為評價指標,分別采用堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶五種商業(yè)蛋白酶水解藍圓鲹蛋白。綜合比較后選擇堿性蛋白酶作為制備藍圓鲹蛋白抗氧化肽的最佳蛋白酶。
　　(2)以水解度為指標,分別采用單因素法和Box-Benhnken Design(BBD)響應面法優(yōu)化堿性蛋白酶水解藍圓鲹蛋白的酶

4、解工藝條件,建立了水解度(Y)與初始底物濃度(S0,X1)、初始酶濃度(E0,X2)、pH(X3)、酶解溫度(T,X4)4個因素之間的二元回歸模型:Y=22.23-1.05X1+0.66X2+0.79X3+1.09X4-0.082X1X2+0.11X1X3+0.16X1X4-0.17X2X3-0.067X2X4-0.25X3X4-0.04X12-0.22X22-0.37X32-0.44X42。并根據(jù)此數(shù)學模型進行參數(shù)最優(yōu)化分析計算得到最

5、佳酶解條件:初始底物濃度16.3g·L1,初始酶濃度0.11g·L1,酶解溫度50.5℃,pH8.18,水解300min,理論上可達到22.2%的水解度值,與模型驗證實驗值22.4%接近。同時,實驗研究發(fā)現(xiàn)藍圓鲹蛋白水解產(chǎn)物的抗氧化活性、氨基酸組成及分子量分布均與水解度密切相關。水解度為23.0%的酶解產(chǎn)物的抗氧化活性較高,與其產(chǎn)物中的抗氧化性氨基酸含量相對應。
　　(3)堿性蛋白酶在45.0℃至65.0℃范圍內(nèi)的酶失活熱動力學性

6、質(zhì)研究表明,堿性蛋白酶失活符合蛋白酶一級熱失活動力學方程。在50.0℃、pH9.5的反應條件下,堿性蛋白酶酶解藍圓鲹蛋白的米氏常數(shù)Km值為29.115g·L1。并建立了堿性蛋白酶可控酶解藍圓鲹蛋白的水解度動力學模型為:DH=5.970×In[1+（34.869×Eo/So+0.045)×t],水解速率動力學模型為:r=(208.1758Eo/So+0.2723)exp[-0.1675(DH)],實驗驗證表明在一定程度上模型數(shù)據(jù)與實驗結(jié)果

7、吻合良好。
　　(4)采用超濾、凝膠層析、高效液相色譜等不同分離純化技術對藍圓鲹蛋白酶解產(chǎn)物進行分離純化,得到抗氧化活性較好的兩個高親水性肽片段B11和B12。采用MALDI-TOF-TOF MS分析鑒定其氨基酸序列結(jié)構,得到B11、B12抗氧化肽氨基酸序列分別為His-Asp-His-Pro-Val-Cys(HDHPVC,707.11Da)和His-Glu-Lys-Val-Cys(HEKVC,615.22Da)。B11、B12經(jīng)

8、化學合成后,分別采用DPPH·清除法、O2·清除法及還原能力法三種體外抗氧化活性檢測法驗證其抗氧化能力。結(jié)果表明兩個抗氧化肽均具有較強的抗氧化能力。
　　(5)對抗氧化肽HDHPVC和HEKVC清除DPPH·反應進行了動力學研究。結(jié)果表明HDHPVC和HEKVC均屬于慢反應動力學性質(zhì),其在固定30min反應時間條件下的EC50值(分別為31.0μM和67.7μM)比穩(wěn)態(tài)條件下的IC50值(分別為9.0μM和14.5μM)偏大3至5

9、倍。HDHPVC和HEKVC的二級反應速率常數(shù)k2分別為2.00×105μM1·s1和0.70×105μM1·s1,表明HEKVC清除能力較差,而HDHPVC清除能力稍遜于對照物GSH（k2為2.30×105μM1·s1)。
　　(6)熱穩(wěn)定性實驗結(jié)果顯示,藍圓鲹多肽(RSH-III,Mw<5.0kDa)具有較好的耐熱性能;在pH≤7的酸、中性環(huán)境中活性保持較好,但不耐堿;藍圓鲹多肽經(jīng)體外胃腸道消化后仍能保持70%左右的抗氧化活性