酶解金槍魚頭蛋白制備抗氧化活性肽的研究.pdf

1、金槍魚是名貴海洋魚類,大多作為罐頭加工或制作生魚片,加工過程中產(chǎn)生的下腳料魚頭、內(nèi)臟,魚骨和魚皮等約占總重量的50％～70％。金槍魚頭蛋白含量豐富,營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高,是一種優(yōu)質(zhì)的蛋白源,是開發(fā)功能食品的優(yōu)質(zhì)原料。
　　 本論文以大眼金槍魚頭作為原料,采用酶解法、比色法、超濾、凝膠層析、高效液相色譜等方法,研究了酶解工藝的主要參數(shù)、酶解物體外體內(nèi)抗氧化活性、抗氧化肽的分離純化等內(nèi)容,取得的主要研究結(jié)果如下:
　　 1、以干基計(jì),

2、大眼金槍魚頭蛋白質(zhì)含量為63.33％,粗脂肪含量為16.72％,是一種高蛋白、高脂肪且氨基酸組成合理的優(yōu)質(zhì)蛋白資源。采用木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、Alcalase2.4L、Typsin和Pepsin五種常用蛋白酶分別酶解金槍魚頭,以酶解產(chǎn)物對(duì)羥基自由基的清除活性為指標(biāo),得到Alcalase2.4L酶解產(chǎn)物的活性最高,在酶解6h時(shí)清除率最大為59.44％；在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上,根據(jù)Box—Behnken的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,設(shè)計(jì)三因素三水平的中

3、心組合實(shí)驗(yàn),考察溫度、加酶量和酶解時(shí)間對(duì)羥基自由基清除率的影響,優(yōu)化酶解條件為:酶解時(shí)間340min、溫度54℃、加酶量為0.38％和自然pH,得到酶解產(chǎn)物的羥基自由基清除率為63.67％。
　　 2、采用多種抗氧化體系評(píng)價(jià)了優(yōu)化酶解條件下制備的酶解物抗氧化活性。酶解物的還原力隨蛋白濃度的增加而增加,在2.5mg/mL-12.5mg/mL濃度范圍內(nèi),二者呈良好的線性關(guān)系(R2=0.9997)；酶解物對(duì)超氧陰離子有較高清除能力,在

4、濃度為5mg/mL時(shí),清除率可達(dá)84.72％,IC50值為1.20 mg/mL；酶解物對(duì)DPPH自由基的清除率隨蛋白濃度增加而增加,在濃度為2mg/mL時(shí),清除率可達(dá)57.80％,IC50值為1.34 mg/mL；在磷脂卵黃體系中,酶解物能有效抑制金屬離子誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng),其抗脂質(zhì)過氧化能力略低于對(duì)照GSH,在5mg/mL時(shí),酶解物對(duì)脂質(zhì)過氧化的抑制率為51.21％,IC50值為4.98mg/mL；在熱誘導(dǎo)大豆油的氧化體系中,不同濃

5、度的酶解物對(duì)大豆油氧化抑制作用有顯著性差異(p<0.05),0.1％酶解物和0.01％BHT的抑制脂質(zhì)過氧化能力相當(dāng)(p>0.05)。高校液相色譜分析酶解物的分子量分布,結(jié)果表明酶解物主要由分子量3KDa以下的肽組成,比例為59.66％,其中有將近40％的低聚肽。
　　 3、采用截留分子量為8KDa、5KDa、3KDa和1KDa的超濾膜對(duì)金槍魚頭蛋白酶解物進(jìn)行初步分離,得到五個(gè)超濾組分,對(duì)各組分清除羥基自由基能力進(jìn)行測(cè)定,活性最

6、高的為組分Ⅴ(<1K),其對(duì)·OH的IC50值為1.38mg/ml；活性最低的為組分Ⅰ(>8K),IC50值為3.15 mg/ml。對(duì)組分Ⅴ的其他抗氧化活性研究表明:組分Ⅴ的還原力隨著添加量增加而增加,略低于酶解物:對(duì)超氧陰離子、DPPH自由基有較好的清除能力,IC50分別為0.73 mg/ml和0.93mg/ml；對(duì)卵黃磷脂氧化和大豆油的熱誘導(dǎo)氧化都有顯著的抑制作用,0.1％的組分Ⅴ和0.01％的BHT效果相當(dāng),能有效延緩油脂的氧化。

7、
　　 4、采用Sephadex G-25葡聚糖凝膠對(duì)組分Ⅴ進(jìn)行層析分離,組分Ⅴ被分成四個(gè)峰,峰Ⅰ分子量分布為1611Da～711Da；峰Ⅱ的分子量介于267Da～82Da之間,峰Ⅲ為游離氨基酸,峰Ⅳ可能是一些雜質(zhì)產(chǎn)生的吸收。與酶解物和組分Ⅴ相比,峰Ⅰ和峰Ⅱ的對(duì)·OH清除活性有顯著提高,IC50值分別為0.929 mg/ml和0.527 mg/ml,峰Ⅲ的羥基自由基清除活性較低,IC50值為1.65mg/ml。分析峰Ⅰ和峰Ⅱ的氨

8、基酸組成表明,峰Ⅰ中87.12％的氨基酸都是以肽的形式存在的,其中Glu、Gly、Ala、Leu和Lys含量高；峰Ⅱ中Tyr、Phe、Leu和Met含量較高,推測(cè)可能與其抗氧化活性有關(guān)。
　　 5、通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)考察了組分Ⅴ對(duì)D-半乳糖損傷小鼠的抗氧化活性。結(jié)果表明:與模型組比較,組分Ⅴ能改善D-半乳糖損傷小鼠的精神狀態(tài),對(duì)小鼠的體重?zé)o顯著影響；低劑量組能提高小鼠的胸腺指數(shù)(p<0.05),對(duì)小鼠的肝臟和脾臟指數(shù)無顯著影響,顯著升