基于內(nèi)源蛋白酶法制備麥胚抗氧化肽及其活性研究.pdf

1、麥胚是小麥加工過程中的副產(chǎn)物，其蛋白質(zhì)含量豐富，但目前主要用作動物飼料，附加值不高。本文以小麥加工的副產(chǎn)物—麥胚為原料（小麥品種為徐麥856、徐州24、徐州25），利用內(nèi)源蛋白酶水解麥胚蛋白，富集麥胚抗氧化肽，并對其結(jié)構(gòu)和活性進行了研究，主要研究結(jié)果如下:
　　 在確定麥胚最適酶解溫度、時間、pH和液料比等單因素的基礎(chǔ)上，以這4因素為自變量，進行響應面優(yōu)化試驗，建立孵育肽含量預測值對編碼自變量的模型:Y=141.84+16.29

2、A+9.93B-16.30C+14.02D-10.22A2-11.88B2-31.94C2。通過模型預測肽含量最大值為171.07 mg/g，此時孵育條件為溫度45℃、時間4.31 h、液料比30、pH4.39，實測結(jié)果為169.04±0.42 mg/g，與預測值無顯著差異，表明本實驗所擬合的模型可以預測試驗響應值和孵育條件之間的關(guān)系。
　　 采用超濾、Sephadex G-25、RP-HPLC等手段進行分離純化麥胚孵育液，考察

3、其比還原力。孵育液經(jīng)過分子量為3 KDa、10 KDa、50 KDa和100 KDa超濾膜超濾，收集活性較高的3 KDa以下濾液，經(jīng)濃縮，上柱（Sephadex G-25）分離，得組分S-1、S-2和S-3，其中S-2組分的活性最高。收集S-2，并濃縮，經(jīng)制備型HPLC分離，得P-1，P-2，P-3組分，其中活性最強的P-3濃縮后，經(jīng)分析型HPLC進一步純化，最后得A-1和A-2組分，A-1的比還原力（9.20±0.81）顯著高于A-2

4、（4.00±0.16），經(jīng)多次收集，最終獲純度達88.59％的抗氧化肽。通過LC-ESI-MS/MS并結(jié)合氨基酸組成分析，確定A-1分子量為520.66 Da，含有纈氨酸和組氨酸，氨基酸一級結(jié)構(gòu)為Val-His-His-His(VHHH)。
　　 為研究VHHH的來源，比較麥胚中4類可溶性蛋白經(jīng)蛋白酶水解后得到的VHHH含量，結(jié)果表明:VHHH在麥胚球蛋白的酶解液中含量最高，達4.33％，其次是麥胚清蛋白(4.05％)，再次是麥

5、胚醇溶蛋白和麥胚谷蛋白（分別為0.57％和0.48％）。表明VHHH主要來自于麥胚球蛋白，其次麥胚清蛋白。通過NCBI數(shù)據(jù)庫查詢，該肽來自小麥的CHY型鋅指蛋白，分子量為29.67KDa。
　　 采用固相有機合成法合成VHHH，經(jīng)純化，最后得到純度為98.36％的標準品。比較VHHH和GSH在羥基自由基、超氧陰離子和DPPH清除、抑制脂質(zhì)過氧化、銅離子螯合等不同體外抗氧化實驗中的能力及對溫度、pH和體內(nèi)蛋白酶體系的穩(wěn)定性。結(jié)果表

6、明:VHHH的清除羥基自由基和超氧陰離子能力強于GSH（清除羥基自由基IC50分別為0.39 mg/mL和0.64 mg/mL，清除超氧陰離子IC50分別為0.73 mg/mL和0.81mg/mL)，而清除DPPH自由基能力和銅離子螯合能力弱于GSH（清除DPPH自由基IC50分別為1.78 mg/mL和0.57 mg/mL，銅離子螯合能力IC50分別為0.64 mg/mL和0.37mg/mL);抑制脂質(zhì)過氧化方面，二者的抑制率均與時間

7、有關(guān)，48 h內(nèi)抑制率沒有明顯差異。溫度高于60℃后VHHH對羥基自由基清除率顯著下降，60℃時其相對值為103.26±2.16％，80℃為90.73±0.13％，100℃為84.18±2.77％;在pH3.0至8.0時，羥基自由基清除率差異不顯著(pH3.0時相對值為100％，pH8.0時為96.19±0.52％);經(jīng)胃蛋白酶水解2h、胰蛋白酶水解2h，羥基自由基清除率從初始的100％下降至4h后的96.03±0.36％，無顯著變化，

8、表明在體外模擬胃腸消化道酶系下VHHH保持穩(wěn)定。
　　 以中性粒細胞為實驗對象，加入H2O2，測定細胞凋亡率、存活率、增殖率及SOD活性，研究VHHH在細胞內(nèi)的抗氧化作用。結(jié)果表明:添加2000μgVHHH后，細胞凋亡率由72.85％下降至23.02％;細胞增殖率(KIT-8) OD值隨VHHH量顯著增加，VHHH添加濃度為0、0.13、0.25、0.50和1.00mg/mL時KIT-8 OD值分別為0.10±0.02、0.12