蛋清蛋白抗氧化肽的酶法制備、微膠囊化及生物活性評(píng)價(jià).pdf

1、我國(guó)蛋品資源豐富，雞蛋蛋清不僅是優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)的來(lái)源，也是生產(chǎn)活性肽的主要原料之一。蛋清蛋白經(jīng)過(guò)一種或多種酶水解后，可形成具有抗氧化特性肽段，蛋清蛋白肽作為一種兼?zhèn)錉I(yíng)養(yǎng)和功能價(jià)值的天然抗氧化劑，可在食品工業(yè)和醫(yī)藥行業(yè)方面發(fā)揮極大作用。而且，在被酶解過(guò)程中，蛋清蛋白的過(guò)敏原蛋白的線性表位和構(gòu)象型表位也可被破壞，從而降低蛋清蛋白的致敏性。
　　本課題以雞蛋蛋清液為原料，選擇合適蛋白酶對(duì)其進(jìn)行酶解的條件優(yōu)化，制備出蛋清蛋白抗氧化肽，并制備蛋

2、清蛋白抗氧化肽的金屬離子（鉀、鈣、鋅、鎂）-肽螯合物；利用銳孔凝固浴法制備蛋清蛋白抗氧化肽微膠囊，并對(duì)微膠囊的緩釋性能及活性進(jìn)行評(píng)價(jià)；采用IgG和IgE結(jié)合能力的方法，評(píng)價(jià)蛋清蛋白抗氧化肽的潛在致敏性；通過(guò)Caco-2細(xì)胞測(cè)定蛋清蛋白抗氧化肽的細(xì)胞增殖毒性。建立Caco-2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型和Caco-2細(xì)胞單層模型，分別對(duì)蛋清蛋白抗氧化肽的氧化損傷作用和在體內(nèi)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)吸收進(jìn)行評(píng)價(jià)。研究的主要方法、結(jié)果及結(jié)論如下。
　　1.根據(jù)

3、酶解液的鐵離子還原/抗氧化能力（FRAP）的大小，篩選出糜蛋白酶和胃蛋白酶水解酶組合，并利用響應(yīng)面法優(yōu)化酶解制備抗蛋清抗氧化肽條件。得到最佳酶解參數(shù)為：糜蛋白酶和胃蛋白酶復(fù)合酶質(zhì)量比例為1.7:1，料水比(v/v)10.52％，加酶量0.4%，預(yù)加熱時(shí)間10 min，酶解時(shí)間3.16 h。在此條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，測(cè)得FRAP值為13.46±0.456μmol AAE/g DW，與響應(yīng)面模型預(yù)測(cè)值13.33μmoL AAE/g DW相

4、近。說(shuō)明該響應(yīng)面模型有效。
　　2.采用截留分子量為3000 u的超濾管超濾，制備出蛋清蛋白抗氧化肽。經(jīng)測(cè)定，其FRAP值為30.86μmol AAE/g DW，超氧陰離子清除率為43.2%，具有較好的抗氧化活性。將制得的蛋清蛋白抗氧化肽分別與鉀、鈣、鋅、鎂離子螯合，制備出金屬離子螯合肽，相比未螯合蛋清蛋白抗氧化肽，螯合后的蛋清蛋白抗氧化肽FRAP值顯著降低（P＜0.001），超氧陰離子清除能力無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

5、>　　3.采用銳孔凝固浴法制備出包埋率為80.17%，粒徑在500-1000μm之間的蛋清蛋白抗氧化肽微膠囊。在模擬胃液中，蛋清蛋白抗氧化肽微膠囊釋放緩慢，在模擬腸液中繼續(xù)釋放，緩釋作用良好；通過(guò)抗氧化活性測(cè)定，說(shuō)明微膠囊化有利于蛋清蛋白抗氧化肽的活性保護(hù)。
　　4.采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法檢測(cè)蛋清蛋白抗氧化肽與IgG和IgE的結(jié)合能力，結(jié)果顯示，與95℃、10 min加熱的蛋清蛋白及其酶解液相比，蛋清蛋白抗氧化肽與IgG和IgE

6、的結(jié)合能力均顯著降低，潛在致敏性降低；采用CCK-8試劑盒檢測(cè)蛋清蛋白抗氧化肽消化前與被消化后的細(xì)胞增殖毒性，未被消化的蛋清蛋白抗氧化肽在100-1600μg/mL的濃度范圍，未檢出細(xì)胞毒性；而經(jīng)過(guò)胃腸消化的蛋清蛋白抗氧化肽在濃度達(dá)到800μg/mL時(shí)，細(xì)胞活力為88.80%，低于參考值95%，開(kāi)始呈現(xiàn)出細(xì)胞毒性。
　　5.利用一定濃度的H2O2誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷，結(jié)果表明：蛋清蛋白抗氧化肽對(duì)細(xì)胞氧化應(yīng)激的損傷具