麥胚蛋白酶解物的制備、結(jié)構(gòu)及其生物活性功能的研究.pdf

1、小麥?zhǔn)俏覈?guó)主要糧食作物之一，其年加工量達(dá)1億噸左右，作為面粉工業(yè)副產(chǎn)品的麥胚年蘊(yùn)藏量達(dá)200～400萬(wàn)噸，實(shí)際提胚量也有20萬(wàn)噸以上。合理開(kāi)發(fā)利用麥胚不僅可為人類(lèi)提供優(yōu)質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)素，消除麥胚混入面粉而產(chǎn)生的各種不良影響，而且提升了隨麩皮作為廉價(jià)飼料出售的麥胚的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，具有較大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。 麥胚含有30％左右的蛋白質(zhì)，是一種潛在的植物蛋白資源，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)麥胚蛋白的研究與開(kāi)發(fā)尚停留在營(yíng)養(yǎng)源水平上。麥胚是具有生命活力的植物

2、胚胎，麥胚蛋白中蘊(yùn)涵著許多具有生物活性的氨基酸序列，用特異的蛋白酶水解就有可能釋放出有活性的肽段，利用麥胚蛋白研究和開(kāi)發(fā)具有某種確切功能的生物活性肽不失為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)麥胚蛋白的有效途徑。 論文首先研究了麥胚蛋白酶解工藝，以體外抗氧化活性及抗腫瘤活性為考察指標(biāo)，從5種商品蛋白酶中確定了酶解的最適水解酶為堿性蛋白酶ProleatherFG-F；通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析優(yōu)化確定麥胚蛋白酶解物(wheatgermproteinHydro

3、lysatesWGPHs)的最佳酶解條件為：[S]5.00％、[E]/[S]4.85％～4.95％、pH9.5、52.25℃～54.00℃、4.00h；最佳酶解條件下制備的WGPHs對(duì)O2-·的清除率和人小細(xì)胞肺癌株H446的增殖抑制率分別為55.85％(1.50mg/mL)和60.65％(0.25mg/mL)，其相對(duì)分子質(zhì)量主要分布在11563～130之間，其中相對(duì)分子質(zhì)量小于3000的組分比例為83.30％，小于1000的組分比例為

4、53.01％，峰值分子量為210的組分含量最高，約占30.65％。 盡管可以通過(guò)酶解工藝的優(yōu)化而獲得分子質(zhì)量相對(duì)較為集中的組分，但蛋白質(zhì)酶解液的成分仍然復(fù)雜多樣，鑒于目前國(guó)內(nèi)外熱點(diǎn)研究的活性肽的相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)都在3000以下，所以有必要對(duì)WGPHs進(jìn)行超濾分離。本研究采用的脫脂麥胚蛋白系堿提酸沉法制備，且水解過(guò)程不可避免地帶入了一些鹽分，這些鹽分的存在不僅會(huì)影響最終產(chǎn)品的品質(zhì)，且會(huì)干擾麥胚蛋白酶解物生理活性的分析，因此，論

5、文研究了大孔吸附樹(shù)脂對(duì)WGPHs的吸附性能和脫鹽效果。結(jié)果表明：采用相對(duì)分子質(zhì)量為3000的聚砜膜對(duì)WGPHs進(jìn)行超濾分離的最適工藝條件為：操作壓力0.30MPa，操作溫度20℃，WGPHs濃度35g/L，超濾有效地除去了料液中相對(duì)分子質(zhì)量較大的組分，清除O2-·的IC50由超濾前的1.64mg.mL-1降至超濾后的1.29mg.mL-1。DA201-C大孔吸附樹(shù)脂對(duì)WGPHs的靜態(tài)吸附與解吸的效果優(yōu)于其它8種樹(shù)脂；動(dòng)態(tài)吸附解吸試驗(yàn)表明

6、：50mg/mL的WGPHs以0.5BV/h流速上樣、1BV/h的流速水洗、1.5mL/min的75％的乙醇解吸后，其脫鹽率和回收率分別為92.25％、78.55％；大孔吸附樹(shù)脂處理后WGPHs中疏水性氨基酸的摩爾百分比從32.64％提高至39.21％，清除O2-IC50由1.29mg.mL-1降至0.66mg.mL-1。 為了充分了解WGPHs作為抗氧化功能因子的潛力，采用8種體外抗氧化模型和不同劑量WGPHs灌胃小鼠試驗(yàn)對(duì)W

7、GPHs的體內(nèi)外抗氧化活性進(jìn)行了研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：WGPHs是良好的電子供體和氫供體；能明顯抑制亞油酸體系的過(guò)氧化作用；能有效地抑制細(xì)胞膜的氧化損傷，使小鼠紅細(xì)胞溶血率降低；具有清除O2-、·OH、DPPH·及活性氧H2O2的能力，其清除自由基的機(jī)制可能是通過(guò)肽類(lèi)對(duì)過(guò)渡金屬離子的螯合來(lái)實(shí)現(xiàn)的；當(dāng)WGPHs的濃度為GSH的3～5倍時(shí)，可達(dá)到與GSH相當(dāng)?shù)目寡趸?，且有較顯著的量效關(guān)系；WGPHs在顯著提高小鼠血清SOD和GSH-Px活

8、性的同時(shí)也能顯著降低血清MDA含量，其作用效果隨著WGPHs劑量的增加而增大。 論文利用大孔吸附樹(shù)脂色譜、凝膠色譜、半制備RP-HPLC、RP-HPLC分離純化，從WGPHs中得到一個(gè)具有較強(qiáng)抗氧化活性的組分WGPHs-B5-fl，運(yùn)用RP-HPLC、氨基酸組成分析和二級(jí)質(zhì)譜分析鑒定其氨基酸序列為Arg-Glu-Trp(REW)，其清除O2-·和螯合Fe2+的IC50分別為103μmol.L-1和62μmol.L-1。采用量子化

9、學(xué)方法對(duì)REW和GSH的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分子模擬，得到了優(yōu)勢(shì)構(gòu)象和優(yōu)勢(shì)構(gòu)象的能量，研究了分子的電荷分布、前線軌道能量等。借助量子化學(xué)計(jì)算結(jié)果解釋了REW的構(gòu)效關(guān)系，REW中的Glu以α-COOH與Trp的α-NH2形成肽鍵；REW和GSH的量子化學(xué)計(jì)算結(jié)果與抗氧化活性大小的一致性表明可以采用前線軌道能級(jí)差來(lái)表征多肽分子的生物活性大?。粡淖匀绘I軌道法得到的凈電荷分布推測(cè)確定了REW分子中自由基反應(yīng)的活性位點(diǎn)及Fe2+-REW螯合物的結(jié)構(gòu)。

10、 從天然抗氧化劑抗氧化作用與抗腫瘤作用之間的密切關(guān)系得到啟示，論文借助于體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，通過(guò)MTT比色法測(cè)定了WGPHs對(duì)人小細(xì)胞肺癌株H446生長(zhǎng)增殖的抑制作用，通過(guò)熒光顯微鏡、流式細(xì)胞術(shù)觀察了凋亡細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)及其對(duì)H446細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡的效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：WGPHs對(duì)體外培養(yǎng)的人小細(xì)胞肺癌株H446有明顯的增殖抑制作用，并有一定的劑量效應(yīng)和時(shí)間效應(yīng)；WGPHs能誘導(dǎo)H446細(xì)胞凋亡；熒光顯微鏡可見(jiàn)H446細(xì)胞出現(xiàn)典型的凋亡

11、細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變：流式細(xì)胞儀檢測(cè)出現(xiàn)典型的亞二倍體凋亡峰。WGPHs在體外可顯著抑制人小細(xì)胞肺癌株H446的生長(zhǎng)增殖，其抗腫瘤機(jī)制主要是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，將細(xì)胞阻滯在G0/G1期，使細(xì)胞不能進(jìn)入S期進(jìn)行DNA合成，從而使H446細(xì)胞的體外增殖受到抑制。利用大孔吸附樹(shù)脂色譜、凝膠色譜、半制備RP-HPLC分離純化，從WGPHs中得到一個(gè)具有較強(qiáng)抗腫瘤活性的組分WGPHs-A2-c4，運(yùn)用RP-HPLC、氨基酸組成分析和二級(jí)質(zhì)譜分析鑒定其氨基