鮟鱇魚魚肉酶解蛋白產(chǎn)物的制備及抗氧化肽活性的研究【畢業(yè)論文】

1、<p>　　本科畢業(yè)論文(設(shè)計(jì))</p><p>　題 目：鮟鱇魚魚肉酶解蛋白產(chǎn)物的制備及抗氧化肽活性的研究</p><p>　學(xué) 院：</p><p>　學(xué)生姓名：</p><p>　專 業(yè)：藥學(xué)</p><p>　班 級：</p><p>　指導(dǎo)教師：<

2、;/p><p>　起止日期：</p><p><b>　　目錄</b></p><p>　　鮟鱇魚魚肉蛋白酶解產(chǎn)物的制備及抗氧化活性研究2</p><p><b>　　1前言4</b></p><p><b>　　2 材料與方法4</b></p&

3、gt;<p><b>　　3結(jié)果與討論6</b></p><p>　　3.1單因素試驗(yàn)6</p><p>　　3.2酶解工藝條件優(yōu)化8</p><p>　　3.3 酶解液超濾分段9</p><p>　　3.4鮟鱇魚抗氧化肽的純化10</p><p><b>　　[

4、參考文獻(xiàn)]13</b></p><p>　　鮟鱇魚魚肉蛋白酶解產(chǎn)物的制備及抗氧化活性研究</p><p>　　[摘　要] 目的：研究鮟鱇魚魚肉蛋白酶解產(chǎn)物的制備工藝及抗氧化活性。方法：以DPPH清除率為指標(biāo)，通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定胰蛋白酶最佳酶解條件，經(jīng)超濾、DEAE-52離子交換色譜和Sephadex G-25 進(jìn)一步分離、提純，檢測各組分的抗氧化活性。結(jié)果：胰蛋白

5、酶酶解鮟鱇魚魚肉蛋白制備抗氧化肽的最佳酶解條件為：溫度30°C、酶解時(shí)間4h、加酶量1.0%、料液比1:3；酶解產(chǎn)物經(jīng)超濾后得到三個(gè)組分LMH-Ⅰ(MW>10kDa)、LMH-Ⅱ(10<MW<5 kDa)和 LMH-Ⅲ(MW<5kDa)，將抗氧化活性最強(qiáng)的LEH-Ⅲ進(jìn)一步經(jīng)DEAE-52離子交換色譜和Sephadex G-25純化之后，得到F11的抗氧化活性最高，濃度5mg/mL時(shí)DDPH自由基清除率達(dá)

6、49.5%。結(jié)論：酶解并經(jīng)過超濾、DEAE-52離子交換色譜和Sephadex G-25純化制備的鮟鱇魚蛋白多肽具有較強(qiáng)的抗氧化能力。</p><p>　　[關(guān)鍵詞] 鮟鱇魚；酶解；抗氧化活性</p><p>　　Antioxidant properties of hydrolysate from Lophius litulon by trypsin were studied</p

7、><p>　　Abstract：Objective Antioxidant properties of hydrolysate from Lophius litulon by trypsin were studied. Method The optimal conditions of trypsin hydrolysis was obtained by single-factor experiments and or

8、thogonal test with the DPPH· scavenging activity as index. The hydrolysate was fractionated by ultrafiltration membrane system and isolated with ion-exchange and gel filtration chromatography. Also, the antioxidant

9、properties of crude protein, crude and fractions of enzymatic hydrolysate were men</p><p>　　Key words: Lophius litulon; enzyme hydrolysate; antioxidative activity</p><p><b>　　1前言</b>

10、</p><p>　　人體在正常生理情況下，自由基的產(chǎn)生與清除處于動(dòng)態(tài)平衡中，但是過量的自由基會使氨基酸、蛋白質(zhì)、脂肪酸等受到強(qiáng)烈的氧化破壞，使它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，造成相關(guān)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞，從而導(dǎo)致許多疾病發(fā)生[1]。因此，自由基的清除對維持人體正常的生理活動(dòng)具有重要的意義。研究發(fā)現(xiàn)，通過酶解法獲得的分子量介于蛋白質(zhì)和氨基酸之間的肽類具有極強(qiáng)的活性[2]，使其成為蛋白質(zhì)類物質(zhì)中最有前途的抗氧化物質(zhì)[3]。

11、蛋白質(zhì)可成為產(chǎn)生活性肽的原料[4]，上世紀(jì)70年代，Hale等人發(fā)現(xiàn)胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶比較適合魚肉蛋白的水解[5]，其中胰蛋白酶是特異性最強(qiáng)的酶。所以，通過蛋白質(zhì)的酶解技術(shù)可得到天然的抗氧化活性肽，以滿足人們對天然抗氧化劑的追求[6]。近年來，隨著人們對安康魚認(rèn)識的逐漸深入，對安康魚研究也開始深入。目前，人們對魚藥用的研究主要集中在，魚甘油和魚肉蛋白當(dāng)中。</p><p>　　鮟鱇魚（Lophius

12、litulon），又名又名蛤蟆魚、結(jié)巴魚等，屬冷溫性底層魚類，在我國主要分布在黃渤海地區(qū)及東海北部，其肉鮮美，富含維生素A和維生素C，如今已成為我國主要漁獲種類之一[7]。安康魚全身都可以食用，而且所含脂肪低、熱量少，更富含豐富的維他命A、D和E，尤其是魚肝有保持視力、預(yù)防肝臟疾病等功效。經(jīng)常食用具有很好的滋補(bǔ)作用能夠預(yù)防高血壓、心血管、風(fēng)濕痛等疾病。近年來，利用酶水解動(dòng)植物蛋白制備蛋白水解物的研究與開發(fā)已成為生產(chǎn)高附加值生物產(chǎn)品的一個(gè)

13、熱點(diǎn)。但目前對鮟鱇魚的研究尚少，對其開發(fā)利用仍處于食用階段。本實(shí)驗(yàn)利用正交實(shí)驗(yàn)對胰蛋白酶酶解制備鮟鱇魚蛋白抗氧化肽的工藝進(jìn)行了優(yōu)化，并利用超濾、DEAE-52離子交換色譜和Sephadex G-25從酶解物中分離得到了活性較高的抗氧化組分，研究結(jié)果為鮟鱇魚蛋白抗氧化肽的開發(fā)提供了依據(jù)。</p><p><b>　　2 材料與方法</b></p><p><b&g

14、t;　　2.1材料與試劑</b></p><p><b>　　2.1.1 材料</b></p><p>　　鮟鱇魚（Lophius litulon）購于浙江舟山市南珍市場，種屬由浙江海洋學(xué)院趙盛龍教授鑒定為黃鮟鱇Lophius litulon，標(biāo)本存放于浙江海洋學(xué)院藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室。</p><p>　　2.1.2 試劑與儀器</p

15、><p>　　胰蛋白酶（上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、DPPH（美國sigma公司）、DEAE-52離子交換樹脂、Sephadex G-25凝膠（上海源聚生物科技有限公司），磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鐵氰化鉀，其它試劑均為分析純自動(dòng)部分收集器（上海琪特儀器分析有限公司）UV-1100紫外可見分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)公司）MSC300超濾杯（上海摩速科學(xué)器材有限公司）CF16RXII高速冷凍離心機(jī)（日本HITACHI公司

16、）</p><p><b>　　2.2 實(shí)驗(yàn)方法</b></p><p>　　2.2.1 鮟鱇魚胰蛋白酶解液制備</p><p>　　將鮟鱇魚去皮、內(nèi)臟和魚骨，收集魚肉，經(jīng)組織搗碎機(jī)攪拌均勻制成肉糜，分袋包裝并密封，于冰箱-20℃保存 。</p><p>　　參照Quaglia，G.B.等人[8]對沙丁魚的酶解方法并做部

17、分修改。精確稱取一定質(zhì)量的鮟鱇魚肉糜，按照一定比例加入超純水與胰蛋白酶，一定溫度水浴進(jìn)行酶解，酶解完成后將酶解液于100℃水浴中加熱15min滅酶，冷卻至室溫后 4℃，4000r/min，5min離心，得上清液，12000r/min離心20min，收集上清液冷凍干燥備用。</p><p>　　2.2.2胰蛋白酶酶解工藝優(yōu)化[8]</p><p>　　以DPPH清除率為指標(biāo)考察料液比、加酶量

18、、酶解溫度、酶解時(shí)間對胰蛋白酶酶解制備鮟鱇魚蛋白抗氧化肽的影響。結(jié)果如圖2～5所示。</p><p>　　根據(jù)單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)確定胰蛋白酶酶解制備鮟鱇魚蛋白抗氧化肽的工藝條件。L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素和水平見表1。</p><p><b>　　表1因素水平表</b></p><p>　　Table 1 The design of fa

19、ctors and the level</p><p>　　2.2.3 鮟鱇魚抗氧化肽分離純化</p><p>　　2.2.3.1 鮟鱇魚活性肽初步分離</p><p>　　將最佳酶解條件下得到的鮟鱇魚胰蛋白酶解液經(jīng)截留分子量為10kDa和5KDa的超濾膜超濾后，分別得到LMH-Ⅰ（MW＞10kDa），LMH-Ⅱ（10kDa＜MW＜5kDa），LMH-Ⅲ(MW＜5

20、kDa）三個(gè)組分。將以上三個(gè)組分冷凍干燥后測定其DPPH自由基清除率，選擇活性高的進(jìn)一步分離純化。</p><p>　　2.2.3.2 鮟鱇魚抗氧化肽進(jìn)一步分離純化</p><p>　　以DPPH清除率為指標(biāo)，將LMH超濾后所得3個(gè)組分中活性較高的部分過DEAE-52陰離子交換色譜，流動(dòng)相為水、0.1mol/L NaCl、0.5mol/L NaCl和1.0mol/L NaCl梯度洗脫，流速

21、為2mL/min，部分收集器每3min一管進(jìn)行收集，洗脫液在280nm下檢測，合并各峰，測定其DPPH自由基清除率，選擇較強(qiáng)組分過Sephadex G-25凝膠柱，以超純水為流動(dòng)相，洗脫速度為2mL/min，部分收集器每3min一管進(jìn)行收集，洗脫液在280nm下檢測，合并各峰后測定其DPPH自由基清除率。</p><p>　　2.2.3.3 DPPH清除率的測定</p><p>　　DPP

22、H自由基清除能力按照Bersuder（1998）描述的方法進(jìn)行。1mL樣品與1mL的99.5%乙醇混合，加入500 μl DPPH濃度為0.02% 的99.5%乙醇溶液?；旌衔镌诎凳沂覝叵路胖?0分鐘，于517 nm處測定吸光值。</p><p>　　自由基清除率按照下面公式計(jì)算：清除率% =（對照+空白-樣品）/對照。</p><p>　　對照：1mL蒸餾水 + 500 μl濃度為0.0

23、2% DPPH 99.5%乙醇液+ 1mL乙醇；</p><p>　　樣品：1mL樣品+ 500μl濃度為0.02% DPPH 99.5%乙醇液 + 1mL乙醇；</p><p>　　空白：1mL樣品 + 500 μl乙醇+ 1mL乙醇。</p><p><b>　　3結(jié)果與討論</b></p><p><b>

24、;　　3.1單因素試驗(yàn)</b></p><p>　　3.1.1料液比對DPPH自由基清除率的影響</p><p>　　在加酶量為1%、溫度為40℃、酶解時(shí)間為3h的條件下，改變料液比大小，酶解液DPPH清除率隨料液比的變化如圖1所示。由圖可知，DPPH清除率在料液比為1:2時(shí)達(dá)到最大值，隨后隨著比值增大DPPH清除率降低，故1:2為最佳料液比。為節(jié)約能源，提高效率選取料液比為1

25、：1、1：2、1：3,為正交實(shí)驗(yàn)水平。</p><p>　　3.1.2加酶量對DPPH自由基清除率的影響</p><p>　　在料液比為1:2，溫度為40℃，酶解時(shí)間為3h的條件下，改變加酶量，酶解液DPPH清除率隨加酶量的變化如圖2所示。由圖2可知，當(dāng)加酶量為1.5%時(shí)，清除率達(dá)到最大，故選擇加酶量為1.5%為最佳條件。為節(jié)約能源，提高效率加酶量0.5%、1%、1.5%為正交水平。<

26、;/p><p>　　3.1.3酶解溫度對DPPH自由基清除率的影響</p><p>　　在料液比為1:2、加酶量為1.5%、酶解時(shí)間為3h的條件下，改變酶解溫度，DPPH清除率隨溫度的變化如圖3所示。由圖可知，酶解溫度為40℃時(shí)，DPPH清除率最高，故40℃為理想酶解溫度。為節(jié)約能源，提高效率選取溫度為30、40、50℃為正交水平。</p><p>　　3.1.4酶解時(shí)

27、間對DPPH自由基清除率的影響</p><p>　　在料液比為1:2、加酶量為1.5%、酶解溫度為40℃下，改變酶解時(shí)間，DPPH隨時(shí)間的變化如圖4所示。由圖可知，酶解時(shí)間為3h時(shí)，DPPH清除率達(dá)到最大，故選擇3h為最佳酶解時(shí)間。為節(jié)約能源，提高效率選取2、3、4小時(shí)為正交實(shí)驗(yàn)水平。</p><p>　　圖1 料液比對DPPH清除率的影響 </p>&l

28、t;p>　　Fig.1 Effects of liquid-solid ratio on the DPPH scavenging rate </p><p>　　圖2 加酶量對DPPH清除率的影響</p><p>　　Fig.2 Effects of enzyme concentration on the DPPH scavenging rate</p><p&

29、gt;　　圖3 酶解溫度對DPPH清除率的影響</p><p>　　Fig.3 Effects of temperature on the DPPH scavenging rate</p><p>　　圖4 酶解時(shí)間對DPPH清除率的影響</p><p>　　Fig.4 Effect of enzymolysis time on the DPPH cavenging

30、 rate </p><p>　　3.2酶解工藝條件優(yōu)化</p><p>　　在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用L9(34)正交試驗(yàn)確定鮟鱇魚蛋白胰蛋白酶解的最佳條件（表2）。對正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差分析，結(jié)果顯示影響胰蛋白酶酶解物對DPPH自由基清除活性的各因素排序?yàn)椋築＞A＞C＞D，即加酶量的影響最大，酶解時(shí)間影響最小。其最佳酶解條件為A3B2C1D3，即料液比為1:

31、3，加酶量為1%，酶解溫度為30℃，酶解時(shí)間為4h。在最佳酶解條件下，濃度10mg/mL的酶解液對DPPH自由基清除率可達(dá)到80.11% </p><p>　　表2 胰蛋白酶酶解物對DPPH清除作用</p><p>　　Tab.2 The scavenging effect of hydrolysastes produced by trypsin on DPPH</p>&l

32、t;p>　　3.3 酶解液超濾分段</p><p>　　將酶解液分別經(jīng)截留分子量為10kDa和5kDa的超濾膜后，得到LEH-Ⅰ(MW＞10kDa)、LEH-Ⅱ(10＜MW＜5 kDa)和 LEH-Ⅲ（MW＜5 kDa）三個(gè)組分，測定其DPPH自由基清除率，結(jié)果分別為30.17%，26.43%，57.1%結(jié)果如圖5。</p><p>　　圖5 不同分子量酶解液DPPH清除率</

33、p><p>　　Fig.5 Different molecular weight enzyme hydrolysates on DPPH cavenging rate</p><p>　　3.4鮟鱇魚抗氧化肽的純化</p><p>　　由圖5可知， LEH-Ⅲ組分清除DPPH自由基能力最強(qiáng)，故選擇該部分過DEAE-52陰離子交換色譜柱，合并各峰并測定其DPPH自由基清除

34、率，結(jié)果如圖5、圖6所示。由圖可知，F(xiàn)1的DPPH自由基清除率為42.69%，F(xiàn)2的DPPH自由基清除率為8.58%，F(xiàn)1的DPPH自由基清除率遠(yuǎn)大于F2，合并F1過Sephadex G-25凝膠柱，結(jié)果如圖7、圖8所示。由圖可知，F(xiàn)11 的DPPH自由基清除率為49.5%，F(xiàn)12 的DPPH自由基清除率為11.16%，F(xiàn)11的DPPH清除能力遠(yuǎn)大于F12，故F11即為目標(biāo)抗氧化肽。</p><p>　　圖5 L

35、EH-Ⅲ DEAE-52層析圖 </p><p>　　Fig.5 Elution profile of LEH-Ⅲ through DEAE-52 celluose anion-exchange chromatography.</p><p>　　圖6 LEH-Ⅲ DEAE-52DPPH清除活性分布圖</p><p>　　Fig.6 The

36、DPPH scavenging activity of LEH-Ⅲ through DEAE-52 celluose anion-exchange chromatography.</p><p>　　圖7 DF1 Sephadex G-25層析圖</p><p>　　Elution profile of DF1 fraction through gel filtration using S

37、ephadex G-25 resin.</p><p>　　圖8 DF1 DPPH清除活性分布圖</p><p>　　Fig.8 The DPPH scavenging activity of DF1 fraction through gel filtration using Sephadex G-25 resin</p><p><b>　　4 結(jié)論&l

38、t;/b></p><p>　　近幾年來，國內(nèi)外專家對魚蛋白抗氧化肽的研究已取得了很大的進(jìn)展，許慶陵等人[10]從鰱魚中提取出具有較高清除羥自由基活性的抗氧化肽，其分子量為2.2kDa；Jae-Young Je等人[11]從鱈魚中提取出抗氧化肽分子量為672 Da；盤賽昆等人對鳙魚酶解物清除羥自由基的研究顯示鳙魚肉酶解物具有清除羥自由基的肽是一些寡肽。本文以鮟鱇魚為原料，優(yōu)化了胰蛋白酶酶解鮟鱇魚肉蛋白的工藝

39、條件。酶解液經(jīng)超濾分段顯示MW＜5kDa部分DPPH的清除率最高為49.5%，酶解液具有抗氧化活性部分集中在低分子肽中，與文獻(xiàn)中魚肉抗氧化肽的分子量范圍相似。因此，蛋白酶解鮟鱇魚肉蛋白制備抗氧化肽是可行的。本實(shí)驗(yàn)通過研究安康魚酶解液的抗氧化活性，研究結(jié)果為安康魚的魚肉蛋白研究提供了依據(jù)，為安康魚的蛋白的加工利用開拓了新途徑。</p><p><b>　　[參考文獻(xiàn)]</b></p>

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60、;　　[35] Suetsuna K, Chen J R. Isolation acharacterization of peptides with antioxidant activity bioprocesses used in isolation and recovery[J]. Curr PHarm Des,2003,9(16):1309-1323</p><p><b>　　附錄Ⅰ 英文翻譯&

61、lt;/b></p><p>　　水解阿拉斯加綠鱈（冷凍阿拉斯加鱈魚片）魚骨蛋白抗氧化肽的分離</p><p>　　Jae-Young Je Pyo-Jam Park Se-Kwon Kim</p><p>　　大韓民國，釜慶大學(xué)，化學(xué)系 釜山608-737，2004年4月30日收到，2004年7月28日公認(rèn)。</p><p>　　[

62、摘要] 阿拉斯加鱈魚魚骨蛋白質(zhì)，這通常是在魚加工過程工業(yè)副產(chǎn)物的廢棄物，用青花魚腸子內(nèi)部的酶來水解。阿拉斯加鱈魚框架蛋白質(zhì)（APH）根據(jù)分子量通過超濾膜5個(gè)主要類型為：APH-1(30-10kDA), APH-1(10-5kDA), APH-1(5-3kDA), APH-1(3-1kDA), APH-1(below 1kDA)進(jìn)行分離。以天然的抗氧化劑生物酚為參照，對APHs的抗氧化活性進(jìn)行調(diào)查比較。通過連續(xù)的SP-Sepha

63、dex C-25, Sephadex G-25色譜柱，高效液相色譜法，更近一步純化數(shù)字表明AHP-V的抗氧化活性最高。氨基酸的凈化順序亮氨酸-脯氨酸-組氨酸-絲氨酸-甘氨酸-絡(luò)氨酸，分子量多肽是672DA。此外，純化后清除率為35%的氨基酸羥基基團(tuán)，在53.6IM激進(jìn)的電子自選共振光譜下研究。</p><p>　　[關(guān)鍵詞] 阿拉斯加鱈魚魚骨蛋白，抗氧化活性，水解，電子自旋共振</p><p

64、><b>　　1.前言</b></p><p>　　活性氧（ROS）和自由基在很多疾病中發(fā)揮著重要作用，比如癌癥（Leanderson,Faresjo,&Tagesson,1997,Muramates等，1995）胃潰瘍（Debashis, Bhattacharjee, & Banerjee,1997; Sussman&Bulkley, 1990）老年癡呆癥、關(guān)

65、節(jié)炎和缺血再灌注（Vajragupta, Boonchoong,&Wongkrajang, 2000）。在有氧生物的呼吸作用下，自由基形成超氧陰離子自由基和羥基自由基是一個(gè)不可避免的結(jié)果。這些激進(jìn)分子是很不穩(wěn)定的能迅速的和其他團(tuán)體或物質(zhì)在體內(nèi)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞和組織損傷。自由基是一種預(yù)防性抗氧化劑。抗氧化劑會演變成不同抗氧化水平的序列。這個(gè)可能說明考慮到其中一個(gè)機(jī)理，氧化應(yīng)激可能引起刺激自由基的連鎖反應(yīng)的脂質(zhì)過氧化的損傷。脂質(zhì)過氧化

66、對食品工業(yè)和消費(fèi)者關(guān)系重大，因?yàn)樗赡軐?dǎo)致不良的味道和潛在的毒性反應(yīng)物質(zhì)(Maillard, Soum, Meydani, & Berset,1996)。許多合成的抗氧化劑如叔丁基羥基茴香醚、丁羥甲苯、丁基氫醌、酸丙酯可以在多個(gè)領(lǐng)域起到延緩脂質(zhì)過氧化作用(</p><p><b>　　2.材料和方法</b></p><p><b>　　2.1材料&l

67、t;/b></p><p>　　阿拉斯加鱈魚魚骨由Dearim公司捐贈（韓國釜山）。青花魚腸子從當(dāng)?shù)氐囊粋€(gè)魚市場獲得儲存在20°C供使用。從濟(jì)南長清西格瑪化工有限公司購買硫氰酸銨、亞油酸、生育酚、SP-Sephadex C-25、Sephadex G-25。米利波公司購買超濾（UF）膜-生物反應(yīng)系統(tǒng)和根據(jù)分子量大小的APH的分級膜。其他所有試劑都是在最高級的商店得到。</p><

68、;p>　　2.2青花魚腸提取粗酶</p><p>　　根據(jù)Kim（2003）的方法從原油中提取青花魚腸蛋白酶。將青花魚腸加到2個(gè)20毫升包含5毫升CaCl2 Tris-HCl緩沖(PH7.4)的容器中，在高速攪拌機(jī)以12000r/min下攪拌2min，同樣的攪拌2次。</p><p>　　被絞碎的勻漿在37°C下加熱2小時(shí)，將9500g用離心機(jī)分離20min。根據(jù)上面的方法

69、取上清液的50%再次離心。去除蛋白質(zhì)的沉淀物，加入相同的蒸餾水，和混合物在9500g下離心10分鐘。將上清液凍干并儲存在20°C直到使用，為2.3做準(zhǔn)備。</p><p>　　2.3小老鼠APH的制備</p><p>　　在優(yōu)化的分析條件(50攝氏度,12小時(shí),pH10.0)，阿拉斯加狹鱈框架蛋白質(zhì)水解和老鼠調(diào)整。比例50:1基體/酶(w / w)。隨后APH煮10分鐘滅活。結(jié)果

70、APH分成5個(gè)能通過超濾膜—生物反應(yīng)系統(tǒng)具有一定分子質(zhì)量分界點(diǎn)30，10，5，3，1kDA ,低。分離設(shè)計(jì)如下：APH-I</p><p>　　APH滲透30kDA的膜不能滲透10kDA的膜；APH-II滲透10kDA的膜不能滲透5kDA的膜；APH-III滲透5kDA的膜不能滲透3kDA的膜；APH-IV滲透3kDA的膜不能滲透1kDA的膜；APH-V滲透1kDA的膜。所有APHs得到后在筒式凍干裝置中用5天時(shí)

71、間凍干。</p><p>　　2.4抗氧化活性測定</p><p>　　APHs抗氧化活性測定是根據(jù)Osawa和Namiki(1985)亞油酸的系統(tǒng)方法。簡單的說，一個(gè)樣品（1.3毫克）溶解在十毫升的50mM磷酸鹽緩沖(pH7.0), 加入一種亞油酸- 0.13毫升，10毫升99.5%乙醇。用蒸餾水將總體積調(diào)整到25ml。將混合物倒入錐形瓶中放在40±1°C黑暗的房間中

72、，根據(jù)氧化鐵硫的測定值評價(jià)抗氧化性。氧化鐵硫的值測定依據(jù)Mitsuta,Yasumoto,Iwami(1996)。反應(yīng)溶液放入亞油酸模型系統(tǒng)中與4.7毫升75%的乙醇，0.1毫升30%的硫氰酸銨，0.1毫升3.5%的HCL溶液混合。3分鐘后，在40±1°C條件下測定氧化鐵硫在500nm的吸光度，氯化亞鐵和硫氰酸鹽不同的區(qū)域。</p><p>　　2.5 AHPs的協(xié)同效應(yīng)</p>

73、<p>　　AHPs協(xié)同效應(yīng)的測定如下：簡單的說，樣品（1.3mg）、生育酚（0.13mg）溶解在10ml50 mMphosphate緩沖液中(pH值7.0)，在加入0.13毫升的亞油酸、10毫升99.5%的乙醇。然后用蒸餾水將溶液調(diào)整到25ml，將溶液倒入錐形瓶中放在40±1°C黑暗的房間中，根據(jù)氧化鐵硫的測定值評價(jià)抗氧化性。</p><p>　　2.6抗氧化肽的分離和氨基酸序列

74、的確定</p><p>　　將AHPs中抗氧化活性最高的APH-V凍干，通過SP-Sephadex C-25交換柱，加入20毫米的醋酸鈉緩沖液（PH值4.0），在同一個(gè)緩沖區(qū)域60毫升/小時(shí)用不同線性的氯化鈉洗脫。將活性成分合并后立刻凍干，將冷凍干產(chǎn)物用蒸餾水通過Sephadex G-25色譜柱進(jìn)一步純化。用流速為60毫升/小時(shí)的蒸餾水洗脫，收集5ml溶液。將一部分抗氧化肽通過形成線性梯度的色譜柱的乙腈含0.1氟

75、酸，流速為三氟乙酸2ml/min反向高效液相色譜進(jìn)一步純化。用離心蒸發(fā)器將活性高的集中使用。代表性抗氧化活性峰柱在一個(gè)線性梯度乙腈，包含0.15三氟乙酸流量為2ml/min純化。最后，通過Perkin-Elmer 491個(gè)蛋白質(zhì)音序器自動(dòng)降解得出一個(gè)獨(dú)立的抗氧化氨基酸序列得出來。</p><p>　　2.7羥基自由基的活性清除</p><p>　　通過iron-catalyzed Habe

76、r–Weiss反應(yīng)形成羥基自由基，通過硝酮自旋形成羥基自由基。通過一個(gè)ESR分光計(jì)檢測自旋加合物的合成。0.2ml純化的肽與0.3ml的氧化物，0.2mlFe2SO4,0.2過氧化氫，PH7.2的磷酸緩沖液，將它轉(zhuǎn)移到100ul的毛細(xì)管中。2.5分鐘后，通過一個(gè)ESR分光計(jì)記錄電子自旋共振光譜。實(shí)驗(yàn)條件如下：336.5±5mT的磁場；功率，1mV；調(diào)制頻率、9.41兆赫；振幅、1·200；掃描時(shí)間，4min。<

77、/p><p><b>　　2.8統(tǒng)計(jì)</b></p><p>　　提出的數(shù)據(jù)是指上述三個(gè)測定。</p><p><b>　　3．結(jié)果與討論</b></p><p>　　每年，魚的產(chǎn)量大約有1億噸。然而，30%做成魚粉。(Kim, Jeon, Byun, Kim, & Lee, 1997; Rec

78、eca,Pena-Vera, & Deaz-Castaneda, 1991)。超過50%的產(chǎn)量加工成副產(chǎn)品，其中包括了骨、皮膚、鰭,內(nèi)臟器官,頭等等。(Nair& Gopakumar, 1982)。在特殊情況下，魚骨包括了魚骨頭、頭、尾巴。：阿拉斯加鱈魚包含了大約61%的蛋白質(zhì)，可作為潛在的生物活性物質(zhì)。此外，在我們的實(shí)驗(yàn)室里，一些抗氧化劑從魚類的加工副產(chǎn)品如黃鰭金槍魚皮膚水解液、黃鰭金槍魚魚骨蛋白水解物、阿拉斯加狹鱈皮

79、膚水解液、阿拉斯加狹鱈框架水解液提取出來。然而，我們研究酶解阿拉斯加狹鱈框架蛋白的抗氧化活性。</p><p>　　圖1在亞油酸自然氧化系統(tǒng)測量氧化鐵硫，根據(jù)氧化鐵硫的值， 測定分離后APHs的抗氧化活性</p><p>　　圖2 APHs分離組合物在亞油酸的自然氧化系統(tǒng)測量氧化鐵硫根據(jù)氧化鐵硫的值評價(jià)其協(xié)同效應(yīng)</p><p>　　圖 3 APH-V凈化的抗氧化活

80、性肽。(A)6天后，SP-Sephadex C-25色譜柱通過氧化鐵硫的方法測定活性分?jǐn)?shù)。洗脫，獲得了60毫升/ h的流量與線性梯度(0 - 1 M)氯化鈉， 20毫升醋酸鈉緩沖,pH值4.0，從圖中得出活性分?jǐn)?shù)。(B)6天后，Sephadex G-25凝膠色譜法(更低的面板)的活動(dòng)和抗氧化組分(上面板)氧化鐵硫測量。用60毫升/小時(shí)蒸餾水洗脫。(C)反相高效液相色譜法(C)模式在Primesphere C18柱的積極分?jǐn)?shù)。6天后，根據(jù)

81、氧化鐵硫測量方法測定3 B(更低的面板)的活動(dòng)和抗氧化組分(上面板)。以2毫升/分鐘流速的35%乙腈為流動(dòng)相，采用高效液相色譜法在215nm紫外檢測器下測定。（Ｄ）反相高效液相色譜進(jìn)一步分離。６天后，測定概況(更低的面板)洗脫餾分和抗活動(dòng)(上方的面板)氧化鐵硫。以2毫升/分鐘流速的35%乙腈為流動(dòng)相，采用高效液相色譜法在215nm紫外檢測器下測定。</p><p>　　3.1分離的APHs 的抗氧化活性</

82、p><p>　　在優(yōu)化條件下，將阿拉斯加鱈魚框架蛋白質(zhì)水解，用5個(gè)截留分子30、10、5、3、1kDA超濾膜-生物反應(yīng)系統(tǒng)分離。圖1是分離后APHs的抗氧化活性。APH-V的分子量是1kDA以下，顯示的抗氧化活性最高，抑制亞油酸過氧化大約為85%。此外，對APHs的協(xié)同效應(yīng)和nonpeptidic抗氧化劑，a-tocopherol進(jìn)行了研究。圖2出了APH-I，APHs都展現(xiàn)出了a-tocopherol協(xié)同作用。no

83、npeptidic 抗氧化劑的協(xié)同作用已經(jīng)在玉米胚芽蛋白酶解物的植物蛋白、酵母蛋白、阿拉斯加狹鱈皮膚明膠水解液、與牛血清白蛋白的抗氧化活性中被證明(Bishov & Henick, 1975; Kim et al., 2001; Hatate,Nagata, & Kochi, 1990)。Chen, Muramoto, Yamauchi,and Nokihara (1996)報(bào)道，盡管一些一些玉米胚芽蛋白酶解物的抗氧化活

84、性很低，但是nonpeptidic抗氧化劑對玉米胚芽蛋白酶解物具有較強(qiáng)的協(xié)同作用。在這項(xiàng)研究中，在a-tocopherol利用共軛亞油酸在水/酒精系統(tǒng)中APH的水解液有抗氧</p><p>　　3.2抗氧化肽的分離</p><p>　　AHP-V溶解在PH為4.0的醋酸鈉緩沖液中，倒入SP-Sephadex C-25線性梯度色譜柱的氯化鈉（0-1M），圖3A分離成6個(gè)部分。把個(gè)個(gè)分離出來的

85、成分收集起來凍干，在亞油酸模型系統(tǒng)中，測量其活性。凍干中活性最大的部分通過Sephadex G-25在圖3B分成4個(gè)部分。</p><p>　　分離出來的個(gè)個(gè)部分凍干，測量其抗氧化活性?；钚宰畲蟮挠梅聪喔咝б合嗌珴ㄔ?0C18（20mm·250mm）用一個(gè)線性梯度乙腈的(0 - 35%)含0.1TFA分離，圖3C分成3個(gè)部分。</p><p>　　將活性大的收集起來，用Capc

86、ell PakC18 ＵＧ－１２（１０ｍｍ·２５０ｍｍ）用一個(gè)線性梯度乙腈的(0 – １5%)含0.1TFA分離純化（圖3Ｄ）。最后，我們得到了一段肽鏈其氨基酸序列為亮氨酸-脯氨酸-組氨酸-絲氨酸-甘氨酸-絡(luò)氨酸(MW 672 Da)。最近，報(bào)道了肽鏈的抗氧化活性(Uchida & Kawakishi,1992; Murase, Nagao, & Terao, 1993; Park et al.,2001)。其

87、活性歸功于唑環(huán)脂質(zhì)的螯合能力。在這個(gè)研究中，抗氧化肽包含一個(gè)組氨酸。另外，多肽殘留的酪氨酸在它的序列中是一個(gè)強(qiáng)有的氫供體。這些結(jié)果表明,抗氧化活性肽的分離是依賴于他們氨基酸的殘留和分子量。</p><p>　　3.3純化肽的羥基自由基的清除作用</p><p>　　羥基自由基在Fe2+/H2O2系統(tǒng)旋轉(zhuǎn)形成，能被一個(gè)ESR譜檢測到。加合物在典型的1:2:2:1 ESR信號如圖所示，圖4。第

88、三個(gè)高峰的光譜代表相多大多數(shù)自旋加合物。在53.6uM下，純化的肽消除35%的羥基自由基。自由基主要種類的活性氧(ROS)都不穩(wěn)定,容易與其他基團(tuán)或身體的物質(zhì)反應(yīng),因而導(dǎo)致細(xì)胞的傷害和人類疾病(Halliwell & Gutteridge,1989)。特別是，在活性氧中化學(xué)活性最強(qiáng)的羥基自由基。他很容易與生物分子如氨基酸、蛋白質(zhì)脫氧核糖核酸反應(yīng)(Cacciuttolo, Trinh, Lumpkin, & Rao, 19

89、93)。因此，清除羥基自由基可能是保護(hù)活體生命對抗疾病一個(gè)最有效的方法。</p><p>　　圖 4 在53.6IM純化肽羥基自由基的清除（A）和（B）控制肽</p><p><b>　　感謝</b></p><p>　　本研究由MOMAF-SGRP,Kitto Life Co資助，這個(gè)研究也是2003年21個(gè)研究項(xiàng)目中韓國所支持的。</

90、p><p><b>　　附錄Ⅱ英文原文</b></p><p>　　Antioxidant activity of a peptide isolated from Alaska</p><p>　　pollack (Theragra chalcogramma) frame protein hydrolysate</p><p&g

91、t;　　Jae-Young Je, Pyo-Jam Park, Se-Kwon Kim *</p><p>　　Department of Chemistry, Pukyong National University, Busan 608-737, Republic of Korea</p><p>　　Received 30 April 2004; accepted 28 July 20

92、04</p><p>　　Abstract Alaska pollack frame protein, which is normally discarded as an industrial by-product in the process of fish plant, was hydrolyzedwith mackerel intestine crude enzyme (MICE). Alaska pol

93、lack frame protein hydrolysate (APH) was fractionated according to the molecular basis into five major types of APH-I (30–10 kDa), APH-II (10–5 kDa), APH-III (5–3 kDa), APH-IV (3–1 kDa), and APH-V (below 1 kDa) using an

94、ultrafiltration (UF) membrane bioreactor system. The antioxidative activity of the AP</p><p>　　Keywords Antioxidative activity; Alaska pollack frame protein; Hydrolysate; Electron spin resonance</p>

95、<p>　　1. Introduction</p><p>　　Reactive oxygen species (ROS) and free radicals play an important role in many diseases such as cancer (Leanderson,Faresjo, & Tagesson, 1997; Muramatsu et al.,1995), g

96、astric ulcers (Debashis, Bhattacharjee, & Banerjee,1997; Sussman&Bulkley, 1990), Alzheimer_s, arthritisand ischemic reperfusion (Vajragupta, Boonchoong,&Wongkrajang, 2000). Formation of free radicals such ass

97、uperoxide anion radical eO__2 T and hydroxyl radical(芆H) is an unavoidable consequence in aerobic organismsduring respiration</p><p>　　Lipid peroxidation is of great concern to the food industry and consumer

98、s because it leads to the development of undesirable off-flavors and potentially toxic reaction products (Maillard, Soum, Meydani, & Berset,1996). Many synthetic antioxidants such as butylated hydroxyanisole, butylat

99、ed hydroxytoluene, t-butylhydroquinone and propyl gallate may be used to retard lipid peroxidation in a lot of fields (Wanita & Lorenz,1996). However, the use of synthetic antioxidants is understrict regulation d<

100、/p><p>　　Gnanasambandam, & Johnson, 1996; Park, Jung,Nam, Shahidi, & Kim, 2001). Therefore, the search for natural antioxidants as alternatives to synthetic ones is of great interest among researchers.

101、Recently, severalstudies have described the antioxidative activity of hydrolysates such as milk casein (Yamaguchi, Naito,Yokoo, & Fujimaki, 1980), soy protein (Pratt, 1972),bovine serum albumin (Yukami, 1972), oil se

102、ed protein(Rhee, Ziprin, & Rhee, 1979), egg-yolk protein (Parket al., 2001), yellowfin sole</p><p>　　In this study, we examined the antioxidative effect of Alaska pollack frame protein hydrolysate (APH),

103、 which is normally discarded industrial waste in the process of fish manufacture.</p><p>　　2. Materials and methods</p><p>　　2.1. Materials</p><p>　　Alaska pollack frame was donated

104、 by Daerim Co.(Busan, Korea). Mackerel intestine was obtained froma local fish market and stored at _20 _C until use.Ammonium thiocyanate, linoleic acid, a-tocopherol,SP-Sephadex C-25 and Sephadex G-25 were purchased fro

105、m Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). The ultrafiltration(UF) membrane bioreactor system (MinitanTM)and membranes for the fractionation of APH, based on molecular weights, were purchased from MilliporeCo. (Bedford, MA).