食品添加劑亞硫酸鈉的肝損傷機(jī)制研究.pdf

1、目的： 文獻(xiàn)報(bào)道和前期體內(nèi)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)亞硫酸鹽可能引起肝細(xì)胞脂肪變性和甘油三酯含量增加,本次試驗(yàn)擬通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)亞硫酸鈉對(duì)肝臟的損傷作用并探討其引起肝細(xì)胞脂肪沉積的可能機(jī)制,為進(jìn)一步研究食品添加劑亞硫酸鹽的健康危害提供可靠的理論基礎(chǔ),并為食品中亞硫酸鹽應(yīng)用限量標(biāo)準(zhǔn)的修定提供一定的科學(xué)依據(jù)。 方法： 將正常人二倍體肝細(xì)胞株HL-7702(簡(jiǎn)稱L-02)培養(yǎng)于含10％胎牛血清(FBS)的DMEM/F12培養(yǎng)基中,分別以

2、不同濃度的亞硫酸鈉(Na2SO3)作用于HL-7702細(xì)胞,其終濃度分別為0mmol/L、0.039mmol/L、0.156mmol/L、0.625mmol/L、2.5mmol/L,并設(shè)陽(yáng)性對(duì)照組(乙醇,3％)。用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化；采用MTT法觀察亞硫酸鈉對(duì)肝細(xì)胞活力的影響；采用生化分析法檢測(cè)不同接觸時(shí)間后各染毒組肝細(xì)胞培養(yǎng)上清中乳酸脫氫酶(LDH)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)的活性和白蛋白、總蛋白的含

3、量；采用酶比色法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)甘油三酯(TG)的水平；應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)HL-7702肝細(xì)胞中與甘油三酯代謝密切相關(guān)的載脂蛋白B100(apo-B100)和載脂蛋白E(apo-E)的表達(dá)情況。 結(jié)果： 1、亞硫酸鈉對(duì)肝細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響：據(jù)倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),Na2SO3染毒24h后,對(duì)照組L-02肝細(xì)胞呈多邊形,單層排列,無(wú)重疊生長(zhǎng),細(xì)胞界限清晰,細(xì)胞貼壁良好；0.039mmol/L染毒組與對(duì)照組相比,細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯

4、變化；0.156mmol/L染毒組出現(xiàn)少量漂浮的圓形細(xì)胞,但仍可見(jiàn)大量正常形態(tài)細(xì)胞；0.625mmol/L染毒組圓形細(xì)胞數(shù)目增多；2.5mmol/L染毒組細(xì)胞的形態(tài)卻明顯異常,呈單個(gè)細(xì)胞貼壁,細(xì)胞數(shù)量減少、體積減小、許多細(xì)胞貼壁能力下降而呈漂浮狀態(tài)、死細(xì)胞增加及細(xì)胞間隙增大等。 2、亞硫酸鈉對(duì)L-02肝細(xì)胞活性的影響：據(jù)MTT比色法的檢測(cè)結(jié)果可見(jiàn),當(dāng)接觸染毒24h后,隨著Na2SO3濃度的增加,細(xì)胞活性抑制率逐漸升高,存在劑量-

5、反應(yīng)關(guān)系(r=0.813,P<0.01)。其中0.625mmol/L和2.5mmol/L Na2SO3染毒組與對(duì)照組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),說(shuō)明Na2SO3在一定范圍內(nèi)具有抑制肝細(xì)胞活性的能力。 3、亞硫酸鈉對(duì)肝細(xì)胞培養(yǎng)上清中LDH的影響：將肝細(xì)胞分別染毒24h、48h和72h后,隨著Na2SO3染毒濃度的增加,各染毒組肝細(xì)胞上清中LDH的活性逐漸升高,并存在明顯的劑量-反應(yīng)關(guān)系(r24=0.841,p<0.0

6、1;r48=0.916,p<0.01;r72=0.619,p<0.01);說(shuō)明Na2SO3可能對(duì)肝細(xì)胞膜的通透性有一定影響。 4、亞硫酸鈉對(duì)肝細(xì)胞培養(yǎng)上清中AST活性的影響： 1)在Na2SO3染毒后24h,隨著染毒濃度的增加,各染毒組肝細(xì)胞培養(yǎng)上清中AST的活性逐漸升高,其中0.625mmol/L組和2.5mmol/L組與陰性對(duì)照組比較有顯著性差異(p<0.05或p<0.01),并存在劑量-反應(yīng)關(guān)系(r24=0.652

7、,p<0.01)。而在染毒48h和72h,各染毒組與對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義； 2)在相同濃度的NaSO3作用下,隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng),肝細(xì)胞培養(yǎng)上清中AST的活性有逐漸降低的趨勢(shì),48h和72h時(shí)間組與24h時(shí)間組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05或p<0.01)。 5、亞硫酸鈉對(duì)肝細(xì)胞培養(yǎng)上清中ALT活性的影響：當(dāng)作用時(shí)間為24h、48h時(shí),隨著Na2SO3染毒濃度的增加,肝細(xì)胞培養(yǎng)上清中ALT的活性逐漸升高,與對(duì)照組比較統(tǒng)

8、計(jì)學(xué)意義(p<0.05或p<0.01);其中染毒24h存在劑量-反應(yīng)關(guān)系(r24=0.873,p<0.01)。而在染毒72h后,各染毒組與對(duì)照組之間的ALT不再具有顯著性差異。以上4、5觀察結(jié)果提示亞硫酸鈉對(duì)肝細(xì)胞的嚴(yán)重?fù)p傷作用主要表現(xiàn)在接觸早期。 6、亞硫酸鈉對(duì)肝細(xì)胞白蛋白和總蛋白合成的影響：在相同的作用時(shí)間條件下,隨著Na2SO3染毒濃度的增加,肝細(xì)胞培養(yǎng)上清中白蛋白和總蛋白的含量與陰性對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)

9、;說(shuō)明Na2SO3對(duì)肝細(xì)胞的白蛋白和總蛋白合成能力無(wú)明顯影響。 7、亞硫酸鈉對(duì)肝細(xì)胞內(nèi)TG水平的影響：當(dāng)Na2SO3作用時(shí)間為24h和48h時(shí),各染毒組HL-7702細(xì)胞內(nèi)TG含量無(wú)顯著性差異(p>0.05);在染毒后72h,0.625mmol/L組TG水平增加,與陰性對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 8、亞硫酸鈉對(duì)肝細(xì)胞apo-B100和apo-E表達(dá)的影響：根據(jù)免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)結(jié)果:Na2SO3接觸24h、48h和72h后,

10、各染毒組肝細(xì)胞內(nèi)apo-B100蛋白表達(dá)無(wú)明顯改變。Na2SO3作用72h后,2.5mmol/L組的apo-E蛋白表達(dá)水平明顯降低,與陰性對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。提示亞硫酸鈉在一定劑量條件下可能對(duì)肝細(xì)胞中apo-E的含量有影響。 結(jié)論： 1、Na2SO3在一定條件下對(duì)HL-7702肝細(xì)胞活性存在一定的抑制作用。 2、Na2SO3在一定條件下可使肝細(xì)胞培養(yǎng)上清中LDH、AST、ALT的活性升高,提示