以木質(zhì)纖維素為原料發(fā)酵生產(chǎn)丙酮丁醇的過(guò)程以及科學(xué)機(jī)理研究.pdf

1、隨著石油資源短缺、石油價(jià)格的不斷上揚(yáng)、以及人們對(duì)能源、環(huán)境問(wèn)題重視程度的提高，生物丁醇作為能源產(chǎn)品正在受到越來(lái)越廣泛重視。本文以玉米芯為原料進(jìn)行了丁醇發(fā)酵研究。同時(shí)分別對(duì)玉米芯原料的濕磨預(yù)處理工藝、酶水解底物的粒徑分布與木質(zhì)纖維素酶水解速率的相關(guān)性、利用梭菌生產(chǎn)丙酮丁醇時(shí)葡萄糖與/或木糖的消耗速率以及不同碳源對(duì)于梭菌相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平的影響、玉米芯水解液發(fā)酵產(chǎn)丁醇的工藝等進(jìn)行了研究。這些研究成果為發(fā)展木質(zhì)纖維素原料生產(chǎn)丁醇技術(shù)提供了理論

2、基礎(chǔ)。
　　 本論文的主要研究結(jié)果如下：
　　 1.酶水解底物粒徑分布和木質(zhì)纖維素酶水解速率相關(guān)性的研究
　　 利用濕磨法對(duì)玉米芯原料進(jìn)行預(yù)處理，并對(duì)濕磨預(yù)處理次數(shù)、磨盤(pán)間隙等對(duì)預(yù)處理效果的影響進(jìn)行了比較。通過(guò)酶解反應(yīng)對(duì)預(yù)處理效果進(jìn)行驗(yàn)證，葡萄糖與木糖的得率分別為71.3％和39.1％，還原糖得率較之未經(jīng)濕磨預(yù)處理組提高了2.24倍。分析發(fā)現(xiàn)，物料濕磨預(yù)處理前后并不會(huì)生成糠醛和5－羥甲基糠醛等對(duì)后續(xù)發(fā)酵有抑制作用

3、的抑制物，水解液可以直接用于后續(xù)發(fā)酵過(guò)程。另外，通過(guò)SEM分析預(yù)處理前后樣品，發(fā)現(xiàn)濕磨預(yù)處理不僅能夠使原料粒徑大幅度減小，同時(shí)能破壞原料的致密結(jié)構(gòu)，使原料呈現(xiàn)絮狀，纖維結(jié)構(gòu)大大暴露，增加了纖維素酶與纖維素鏈的接觸面積。而X射線衍射試驗(yàn)表明，濕磨預(yù)處理方法對(duì)于原料纖維素結(jié)晶度影響不大。通過(guò)粒徑分布研究，發(fā)現(xiàn)粒徑分布的Frequency90％值能夠快速且準(zhǔn)確的判定濕磨預(yù)處理過(guò)程的終點(diǎn)，為濕磨預(yù)處理方法的工業(yè)化應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
　　

4、2.濕磨預(yù)處理玉米芯原料發(fā)酵生產(chǎn)ABE研究
　　 本研究直接利用濕磨預(yù)處理玉米芯原料水解液發(fā)酵生產(chǎn)ABE，其發(fā)酵過(guò)程與純糖作為碳源的對(duì)照組相比較，發(fā)現(xiàn)前者的發(fā)酵速率沒(méi)有被抑制，說(shuō)明在預(yù)處理過(guò)程中沒(méi)有產(chǎn)生抑制微生物生產(chǎn)丙酮丁醇的毒性物質(zhì)。預(yù)處理后的原料無(wú)需進(jìn)行脫毒處理便可直接用于ABE發(fā)酵，大大簡(jiǎn)化了操作程序并降低了生產(chǎn)成本。
　　 當(dāng)以30 g/L葡萄糖為唯一碳源時(shí)，經(jīng)過(guò)60 h發(fā)酵，葡萄糖基本耗盡，ABE生產(chǎn)速率與得率

5、分別為0.20 g/L·h和0.36 g/g還原糖。當(dāng)以35 g/L葡萄糖與25 g/L木糖組成的混合糖作為碳源時(shí)，經(jīng)過(guò)72 h發(fā)酵，結(jié)束時(shí)仍有44％的木糖剩余，ABE生產(chǎn)速率與得率分別為0.22 g/L·h和0.35 g/g糖。玉米芯水解液發(fā)酵過(guò)程(SHF)ABE生產(chǎn)速率與得率分別為0.17 g/L·h和0.34 g/g還原糖，與葡萄糖組及混合糖組相似。結(jié)果說(shuō)明濕磨預(yù)處理玉米芯原料可以用于發(fā)酵生產(chǎn)ABE。相對(duì)于SHF工藝中0.12 g

6、/L·h的ABE生產(chǎn)速率，SSF中的ABE生產(chǎn)速率較高，為0.15 g/L·h。分析原因，可能是因?yàn)镾SF中同步糖化與發(fā)酵過(guò)程中水解產(chǎn)生的單糖被轉(zhuǎn)化成丙酮丁醇，消除了底物抑制，從而提高了底物水解效率所致。通過(guò)對(duì)SHF與SSF兩種工藝中物料與能量進(jìn)行衡算，SSF工藝中的能量得率為142％，高于SHF工藝的112％。上述結(jié)果表明，濕磨法是一種溫和的預(yù)處理方法，預(yù)處理過(guò)程中不會(huì)生成對(duì)后續(xù)發(fā)酵有抑制作用的副產(chǎn)物，減化了工藝的后續(xù)脫毒過(guò)程并降低了

7、成本，經(jīng)過(guò)其處理的玉米芯可以被用作生產(chǎn)ABE的原料。
　　 3.同步利用混合糖生產(chǎn)丙酮丁醇菌糖代謝特性研究
　　 通過(guò)富集、分離獲得一株能夠同步代謝葡萄糖與木糖產(chǎn)丁醇的菌株，經(jīng)過(guò)形態(tài)及16S rRNA分析，初步鑒定為Clostridium beijerinckii，命名為SE-2。菌株SE-2分別以葡萄糖或木糖為碳源時(shí)的糖初始利用速率分別為0.8 g/L·h和1.0 g/L·h，兩種糖的利用速率基本相同。改變培養(yǎng)基中葡萄

8、糖與木糖比例為1:2，2:1與1:1，發(fā)酵過(guò)程中兩種糖仍能同步利用，而且糖利用速率基本一致，分別為0.57 g/L·h、0.55 g/L·h和0.56 g/L·h。此外，利用補(bǔ)糖方式對(duì)SE-2的葡糖糖與木糖利用特點(diǎn)研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)發(fā)酵過(guò)程由單糖轉(zhuǎn)化為雙糖時(shí)，原有單糖的利用速率下降，但是雙糖的利用速率之和基本維持與補(bǔ)糖前一致，說(shuō)明只要有葡萄糖或者木糖存在，SE-2便能立刻啟動(dòng)對(duì)該糖的代謝過(guò)程。發(fā)酵過(guò)程動(dòng)力學(xué)分析進(jìn)一步說(shuō)明，菌株SE-2不僅可以

9、同步利用葡萄糖與木糖，而且木糖初始代謝速率要略高于葡萄糖。
　　 4.C.beijerinckii SE-2發(fā)酵玉米芯水解液產(chǎn)丁醇條件的優(yōu)化
　　 以玉米芯水解液為原料，進(jìn)行了C.beijerinckii SE-2生產(chǎn)丁醇發(fā)酵工藝優(yōu)化實(shí)驗(yàn)研究。首先通過(guò)單因素法對(duì)產(chǎn)丁醇條件進(jìn)行了初步優(yōu)化，然后通過(guò)響應(yīng)面設(shè)計(jì)對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，最后獲得優(yōu)化工藝條件。在此條件下，丁醇濃度達(dá)到11.71 g/L，比優(yōu)化前提高42％。在優(yōu)化條

10、件下進(jìn)行玉米芯水解液發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，分批次發(fā)酵(5次)，丁醇產(chǎn)量平均值為11.65±0.47 g/L，實(shí)驗(yàn)值與理論預(yù)測(cè)值非常接近，可見(jiàn)該模型可以較好地預(yù)測(cè)C.beijerinckii SE-2利用玉米芯水解液產(chǎn)丁醇的實(shí)際發(fā)酵情況。菌株優(yōu)化后將酵母粉替換為相對(duì)便宜的玉米漿，這為工業(yè)化放大奠定了基礎(chǔ)。
　　 5.利用梭菌生產(chǎn)丙酮丁醇時(shí)葡萄糖與/或木糖的消耗速率以及不同碳源對(duì)于梭菌相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平的影響
　　 本研究

11、中利用R-T-qPCR對(duì)C.beijerinckii SE-2中10個(gè)與木糖代謝相關(guān)的基因(Cbei_4126、Cbei__0549、Cbei_4455、Cbei_2657、Cbei_0109、Cbei_2389、Cbei_4457、Cbei_4448、Cbei_2385和Cbei_2384)在不同碳源條件下的轉(zhuǎn)錄差異進(jìn)行了分析。發(fā)現(xiàn)這些基因在不同碳源(葡萄糖、木糖或葡萄糖與木糖)發(fā)酵過(guò)程中在轉(zhuǎn)錄水平上是有差異的且都受葡萄糖阻遏。其中基

12、因Cbei_2384、Cbei_2385和Cbei_2389可能存在于同一操縱子上，參與了木糖至5-磷酸-木酮糖轉(zhuǎn)化過(guò)程。與文獻(xiàn)報(bào)道中C.beijerinckii相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄情況不同，基因Cbei_2384、Cbei_2385和Cbei_2389在混合糖發(fā)酵過(guò)程中轉(zhuǎn)錄水平明顯下降，說(shuō)明“葡萄糖阻遏效應(yīng)”在菌株C.beijrinckii SE-2中依然存在。通過(guò)分析，推測(cè)菌株C.beijerinckii SE-2葡萄糖與木糖同步代謝的關(guān)鍵