低能離子注入選育高酶活L-半胱氨酸轉(zhuǎn)化菌株及相關(guān)酶基因研究.pdf

1、L-半胱氨酸是一種在醫(yī)藥、食品、化妝品等行業(yè)得到廣泛應(yīng)用的脂肪族氨基酸，是合成谷胱甘肽、硫胺素、生物素等重要生物化學(xué)制品的原料，市場需求量相當(dāng)大。目前，L-半胱氨酸主要通過傳統(tǒng)的毛發(fā)水解后還原法、化學(xué)合成方法得到，不僅產(chǎn)量低、產(chǎn)品不專一且污染嚴(yán)重。微生物酶轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-半胱氨酸因其具有反應(yīng)條件溫和、專一性強(qiáng)、對環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)而備受關(guān)注。
　　本文在實(shí)驗(yàn)室前期研究基礎(chǔ)上，對微生物酶法轉(zhuǎn)化DL-2-氨基-△2-噻唑啉-4-羧酸(DL-A

2、TC)生產(chǎn)L-半胱氨酸的菌株進(jìn)行誘變選育，對誘變菌株產(chǎn)L-半胱氨酸酶系相關(guān)基因的基因序列及蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比對分析以及對菌體產(chǎn)酶培養(yǎng)基及罐體發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。
　　以具有L-半胱氨酸轉(zhuǎn)化能力的Pseudomonas sp.B-3為出發(fā)菌株，采用低能N+注入誘變技術(shù)對其能進(jìn)行誘變處理，篩選獲得了一株高酶活，且遺傳穩(wěn)定的突變菌株P(guān)seudomonas sp.C-25，其最佳底物濃度由原來的25 g/L提高到30 g/L，最高酶活為274

3、8 U/mL，與原菌株相比提高了26.3％。
　　為探究酶活性提高的分子機(jī)制，分別擴(kuò)增了出發(fā)菌株P(guān)seudomonassp.B-3和突變菌株P(guān)seudomonas sp.C-25產(chǎn)L-半胱氨酸酶系中的L-ATC水解酶，N-氨甲酰-L-半胱氨酸(L-NCC)水解酶和L-半胱氨酸脫巰基酶基因并對其基因序列及蛋白質(zhì)序列進(jìn)行了比較。并利用I-TASSER模擬以上3種酶的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)。由序列比對及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模擬結(jié)果可知，經(jīng)誘變后，L-AT

4、C水解酶基因序列的203th核苷酸由原來的A變?yōu)镚，相應(yīng)的68th氨基酸由原來的天冬氨酸(Asp)變?yōu)楦拾彼?Gly)，且突變位點(diǎn)發(fā)生在酶結(jié)合位點(diǎn)Asp68處，說明突變可能改變了結(jié)合位點(diǎn)結(jié)構(gòu)，使得酶活力有所提高。L-NCC水解酶基因序列的212th核苷酸由原來的T變?yōu)镃，相應(yīng)的71th氨基酸由原來的異亮氨酸(Ile)變?yōu)樘K氨酸(Thr);1052th核苷酸由原來的C變?yōu)門，相應(yīng)的351th氨基酸由原來的組氨酸(His)變?yōu)槔野彼幔═yr

5、），且突變位點(diǎn)71th與酶結(jié)合位點(diǎn)Arg70非常接近，蘇氨酸和酪氨酸都是極性氨基酸，可推斷這兩個氨基酸殘基可能改變了該酶的親水性，進(jìn)而改變了酶的活性。L-半胱氨酸脫巰基酶基因930th核苷酸由原來的C變?yōu)镚，相應(yīng)的301th氨基酸由原來的半胱氨酸(Cys)變?yōu)樯彼?Try)，465th核苷酸由原來的G變?yōu)門，而氨基酸序列無變化，為無意突變。該酶基因突變位點(diǎn)沒有發(fā)生在酶結(jié)合位點(diǎn)附近，可推測對酶活及酶穩(wěn)定性無太大影響。這些信息為該酶系的進(jìn)

6、一步研究奠定了一定的基礎(chǔ)。
　　為優(yōu)化Pseudomonas sp.C-25的產(chǎn)酶條件，利用單因數(shù)實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面法對突變株的產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成進(jìn)行了優(yōu)化。優(yōu)化結(jié)果為:DL-ATC·3H2O4.7g/L、甘油16.0 g/L、牛肉膏6.5 g/L、酵母膏4.0 g/L、蛋白胨5.0 g/L、氯化鈉3.0 g/L、MnSO4·H2O0.02 g/L、MgSO4·7H2O0.5g/L。在優(yōu)化培養(yǎng)基條件下，誘變菌株的酶活力達(dá)3301 U/mL，

7、較優(yōu)化前提高了18.6％。
　　在搖瓶發(fā)酵的基礎(chǔ)上，利用7 L NBS BioFlo415原位滅菌發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。通過溶氧量(DO)關(guān)聯(lián)控制通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速的方法增加了調(diào)控的可操作性。菌體在溶氧量為30～40％時菌體酶活力最高。通過對誘導(dǎo)劑DL-ATC·3H2O添加時間的優(yōu)化，確定了在進(jìn)入對數(shù)生長期時(2 h)添加最為合適，其酶活達(dá)到4668 U/mL，較搖瓶發(fā)酵提高了41.4％。此外，發(fā)酵時間較搖瓶提前了10 h左右。此時菌