高產(chǎn)右旋糖酐酶菌株的篩選及酶學(xué)性質(zhì)和酶的應(yīng)用研究.pdf

1、右旋糖酐酶(Dextranase，E.C.3.2.1.11)能夠催化水解右旋糖酐中的α-1，6糖苷鍵，并釋放出異麥芽糖、異麥芽三糖等。右旋糖酐酶在催化水解高分子右旋糖酐制備藥用右旋糖酐起著關(guān)鍵的作用。
　　本研究從土壤中篩選獲得4株產(chǎn)右旋糖酐酶的活性真菌，對(duì)其中兩株F100I和F1002進(jìn)行深入研究，通過菌株形態(tài)、培養(yǎng)特征以及ITS rDNA序列分析，確定F1001為棘孢青霉，F(xiàn)1002為哈茨木霉：隨后對(duì)菌株F1001和菌株F10

2、02發(fā)酵條件進(jìn)行初步研究，確定兩種菌株的最佳碳源為右旋糖酐T70，最佳氮源為NaNO3。菌株F1001的最佳培養(yǎng)條件為培養(yǎng)基初始pH為5.0，最適培養(yǎng)溫度為28℃，培養(yǎng)時(shí)間為5天；菌株F1002的最佳培養(yǎng)條件為培養(yǎng)基初始pH為6.0，最適培養(yǎng)溫度為28℃，培養(yǎng)時(shí)間為6天。分別對(duì)棘孢青霉及哈茨木霉右旋糖酐酶進(jìn)行分離純化，經(jīng)過硫酸銨分級(jí)沉淀和Sepharose6B凝膠色譜層析分離得到右旋糖酐酶，棘孢青霉右旋糖酐酶從粗酶液到最后純化產(chǎn)物共純化

3、了7.884倍，回收率為13.2%，純化后酶的比活力高達(dá)20608 U/mg；而哈茨木霉右旋糖酐酶從粗酶液到最后純化產(chǎn)物共純化了8.3倍，回收率為10.73%，純化后酶的比活力高達(dá)2782IU/mg；通過聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)測(cè)得棘孢青霉右旋糖酐酶的分子量為66 kDa左右，哈茨木霉右旋糖酐酶分子量為62 kDa左右：隨后對(duì)兩種酶的酶學(xué)性質(zhì)做了初步研究，棘孢青霉右旋糖酐酶的酶促反應(yīng)的最適溫度為35℃，最適pH為5.0。酶

4、的最適底物為右旋糖酐T70，最適底物濃度為3%，酶催化水解右旋糖酐的主產(chǎn)物為異麥芽糖，確定該酶為內(nèi)切右旋糖酐酶。Cu2+和Zn2+對(duì)酶活有較強(qiáng)的促進(jìn)作用，低濃度的Cu2+使酶活力提高到134.7%，Mn2+對(duì)酶催化活力抑制作用較強(qiáng)；哈茨木霉右旋糖酐酶的酶促反應(yīng)的最適溫度為25℃，最適pH為5.0。酶的最適底物為右旋糖酐T70，最適底物濃度為5%，酶催化水解右旋糖酐的主產(chǎn)物為異麥芽糖，確定該酶也為內(nèi)切右旋糖酐酶。Mg2+、Al3+、Zn2

5、+對(duì)哈茨木霉右旋糖酐酶酶活具有促進(jìn)作用，分別使活力提高到108.71%、110.20%、124.22%，然而Mn2+和Ca2+對(duì)酶活有較強(qiáng)的抑制作用。
　　隨后采用右旋糖酐蔗糖酶及棘孢青霉右旋糖酐酶定向制備分子量可控的右旋糖酐，最終確定最佳生產(chǎn)工藝條件為右旋糖酐蔗糖酶濃度為2EIU/mL、蔗糖底物濃度為12%，反應(yīng)24h后，加入右旋糖酐酶使其終濃度為0.23U/mL，反應(yīng)180min后終止反應(yīng)。采用無水乙醇分級(jí)醇沉獲得三種分子量不