原發(fā)性肝癌術(shù)后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)分子預(yù)測(cè)模型的優(yōu)化整合與臨床轉(zhuǎn)化.pdf

1、肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)（簡(jiǎn)稱肝癌）是全球最常見的惡性腫瘤之一，在中國(guó)肝癌的發(fā)病率居腫瘤發(fā)病率的第三位，而其死亡率居第二位。雖然對(duì)肝癌防治的研究已取得巨大進(jìn)展，根治切除術(shù)后的十年生存率已提高到30％左右，但肝癌根治性切除術(shù)后5年轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率仍為60-70％，即使是小肝癌也達(dá)43.5％。轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)已成為進(jìn)一步延長(zhǎng)肝癌患者生存期、提高遠(yuǎn)期療效的瓶頸，也是最終攻克肝癌的關(guān)鍵。探求轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)相關(guān)的分子模

2、型可以為肝癌患者預(yù)測(cè)臨床結(jié)果提供有益信息，并為術(shù)后甄別需要接受輔助治療的患者提供幫助。
　　肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)是多因素、多步驟參與的病理過程，是腫瘤細(xì)胞自身基因改變和宿主微環(huán)境相互作用的結(jié)果。迄今，尚無一個(gè)基因或基因組合能夠用于臨床預(yù)測(cè)肝癌預(yù)后，基于傳統(tǒng)的臨床指標(biāo)和分期只能粗略區(qū)分不同分期的肝癌，無法滿足臨床實(shí)踐中個(gè)體化治療越來越高的要求。研究肝癌本身生物學(xué)特性和宿主免疫相關(guān)因素可能更利于理解肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的機(jī)制以及臨床預(yù)測(cè)。
　　

3、本所前期采用全基因組微陣列技術(shù)，先在肝癌組織中的發(fā)現(xiàn)并建立了153個(gè)基因的肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)預(yù)測(cè)模型，后又在癌旁組織建立了由17個(gè)炎癥免疫相關(guān)細(xì)胞因子構(gòu)成的分子預(yù)測(cè)模型可以準(zhǔn)確預(yù)測(cè)肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)。本研究在前期工作的基礎(chǔ)上，從基因、蛋白各水平進(jìn)一步驗(yàn)證和優(yōu)化整合基于癌和癌周組織以及血清的預(yù)測(cè)標(biāo)簽、評(píng)估其對(duì)肝癌術(shù)后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)和生存的預(yù)測(cè)價(jià)值以及對(duì)術(shù)后復(fù)發(fā)的監(jiān)測(cè)意義，探索它們向臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化的可行性。
　　第一部分，基于組織的肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)預(yù)測(cè)模型的

4、優(yōu)化整合與臨床轉(zhuǎn)化
　　一.基于癌組織的肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)預(yù)測(cè)模型的驗(yàn)證與優(yōu)化
　　目的:肝癌患者預(yù)后預(yù)測(cè)仍然困難，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)基于癌組織的153個(gè)基因的預(yù)測(cè)模型可以預(yù)測(cè)肝癌術(shù)后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)。本研究擬進(jìn)一步在大樣本中驗(yàn)證優(yōu)化此模型，檢驗(yàn)其對(duì)肝癌根治術(shù)后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)效能。
　　方法:應(yīng)用生物信息學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)方法從基于癌組織的153個(gè)預(yù)測(cè)模型中篩選出26個(gè)與復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的分子，采用qRT-PCR檢測(cè)訓(xùn)練組361例患者肝癌

5、組織中這26個(gè)基因的mRNA表達(dá)水平。進(jìn)一步優(yōu)化構(gòu)建有效的分子預(yù)測(cè)模型，分析其與肝癌術(shù)后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的關(guān)系，并在288例患者的驗(yàn)證組中評(píng)估預(yù)測(cè)效能;并對(duì)其中重要基因在細(xì)胞系水平進(jìn)行了驗(yàn)證。
　　結(jié)果:在訓(xùn)練組361例肝癌患者中應(yīng)用log-rank法分別檢驗(yàn)26種基因與轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的關(guān)系，按關(guān)系的大小排序SPP2(P＜0.01)，ENO2(P＜0.01)，ASPH(P＜0.01)，F(xiàn)KBP10(P＜0.01)及SAFB2(P＜0.01)依次

6、為前5位?；贑ox風(fēng)險(xiǎn)比例回歸模型發(fā)現(xiàn)包含這5個(gè)基因的預(yù)測(cè)模型可以較準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)該組361例患者的復(fù)發(fā)情況(HR=1.98，95％CI=1.52-2.59; P＜0.001)，并且可作為肝癌術(shù)后總體生存期預(yù)測(cè)指標(biāo)。根據(jù)該模型將驗(yàn)證組288例患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組，Kaplan-Meier分析顯示高風(fēng)險(xiǎn)組中位至復(fù)發(fā)時(shí)間顯著短于低風(fēng)險(xiǎn)組(HR=1.37，95％CI=1.03-1.82; P=0.032)，高風(fēng)險(xiǎn)組中位總生存期也短于低風(fēng)險(xiǎn)

7、組（P＜0.05）。在不同肝癌細(xì)胞株中ENO2與ASPH的蛋白表達(dá)水平隨著細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能的增加而升高。
　　結(jié)論:前期從基因芯片中篩選出的153個(gè)基因，經(jīng)qRT-PCR大樣本驗(yàn)證優(yōu)化為5基因的預(yù)測(cè)模型可以較準(zhǔn)確預(yù)測(cè)肝癌術(shù)后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)。
　　二.基于癌旁組織的肝癌預(yù)后預(yù)測(cè)模型的驗(yàn)證與優(yōu)化
　　目的:進(jìn)一步在大樣本中驗(yàn)證優(yōu)化前期基于癌旁組織的免疫炎癥相關(guān)因子的預(yù)測(cè)模型，評(píng)估其對(duì)肝癌根治術(shù)后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)和生存的預(yù)測(cè)價(jià)值。
　　

8、方法:我們隨機(jī)選取了3組在復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院行根治性手術(shù)切除的肝細(xì)胞癌患者，包括訓(xùn)練組180例，驗(yàn)證A組200例及驗(yàn)證B組188例。在訓(xùn)練組利用熒光定量PCR技術(shù)，優(yōu)化驗(yàn)證癌旁(IL-6、CSF-1、SPP1、TNF及HLADRA)5基因預(yù)測(cè)模型，然后在驗(yàn)證A組中對(duì)該模型進(jìn)行驗(yàn)證;在驗(yàn)證B組中利用組織芯片、免疫組織化學(xué)技術(shù)，驗(yàn)證“癌旁5基因預(yù)測(cè)模型”的穩(wěn)定性、有效性。
　　結(jié)果:在訓(xùn)練組180例肝癌患者中應(yīng)用log-rank法檢

9、驗(yàn)10個(gè)與肝癌預(yù)后密切相關(guān)的因子，排序后IL-6，CSF-1，SPP1，TNF和HLADRA為前5位，應(yīng)用這5個(gè)免疫炎癥相關(guān)細(xì)胞因子可以區(qū)別肝癌患者預(yù)后?；贑ox風(fēng)險(xiǎn)比例回歸模型發(fā)現(xiàn)包含這5個(gè)基因的預(yù)測(cè)模型可以較準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)訓(xùn)練組患者中位總生存情況(HR=2.19，95％CI=1.55-3.08;P＜0.001)。驗(yàn)證A組200例患者根據(jù)閾值被分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組，Kaplan-Meier分析顯示高風(fēng)險(xiǎn)組中位生存期顯著短于低風(fēng)險(xiǎn)組(H

10、R=1.37，95％CI=1.03-1.82; P＜0.001)。利用免疫組織化學(xué)技術(shù)證實(shí)驗(yàn)證B組中CSF-1，SPP1，TNF和HLADRA的蛋白表達(dá)水平與mRNA一致。
　　結(jié)論:前期的基于肝癌癌旁組織的預(yù)測(cè)模型經(jīng)大樣本qRT-PCR驗(yàn)證優(yōu)化為5基因的預(yù)測(cè)模型可以較準(zhǔn)確預(yù)測(cè)肝癌術(shù)后生存情況。
　　三.癌與癌旁轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)分子預(yù)測(cè)模型的整合與臨床轉(zhuǎn)化
　　目的:整合基于癌和癌旁組織的預(yù)測(cè)模型，在前瞻性研究隊(duì)列中進(jìn)一步評(píng)估

11、其預(yù)測(cè)價(jià)值及臨床應(yīng)用的可行性，組裝預(yù)測(cè)試劑盒。
　　方法:續(xù)貫納入的368例原發(fā)性肝癌患者作為前瞻性隊(duì)列，具有癌與癌旁配對(duì)組織樣本。應(yīng)用Kaplan-Meier法比較不同組間的總生存時(shí)間(OS)和至復(fù)發(fā)時(shí)間(TTR)差異，應(yīng)用Harrell一致性指數(shù)(C-index)比較兩模型及其與傳統(tǒng)臨床分期的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性，進(jìn)而優(yōu)化整合提出更為準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)模型。
　　結(jié)果:根據(jù)基于癌或癌旁組織的預(yù)測(cè)模型所將納入研究隊(duì)列的患者歸類為高風(fēng)險(xiǎn)組或低

12、風(fēng)險(xiǎn)組，臨床隨訪觀察其復(fù)發(fā)和生存情況，將預(yù)期與實(shí)際情況對(duì)比。研究發(fā)現(xiàn)根據(jù)預(yù)測(cè)模型劃分的高風(fēng)險(xiǎn)患者較低風(fēng)險(xiǎn)患者術(shù)后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)（p＜0.05）及死亡（p＜0.05)的危險(xiǎn)均明顯增高。一致性指數(shù)(C-index)比較預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性發(fā)現(xiàn)基于癌組織的預(yù)測(cè)模型對(duì)復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)效果更好，基于癌旁組織的預(yù)測(cè)模型則對(duì)生存預(yù)測(cè)效果較好。將兩者都整合到現(xiàn)有臨床分期系統(tǒng)之后，效能進(jìn)一步提高，并組裝可用于臨床的預(yù)測(cè)試劑盒。
　　結(jié)論:基于癌與癌旁組織的預(yù)測(cè)模型在前瞻

13、性隊(duì)列中能較為準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)肝癌術(shù)后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)與生存，將其與現(xiàn)有臨床分期整合可以提高預(yù)測(cè)效能。
　　第二部分血清OPN在肝癌術(shù)后的動(dòng)態(tài)變化及其對(duì)肝癌復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)的意義
　　目的:術(shù)前血清骨橋蛋白(OPN)已經(jīng)被證明與腫瘤的預(yù)后密切相關(guān)，本研究旨在探索肝癌術(shù)后血清OPN動(dòng)態(tài)變化及其在肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)中的意義。
　　方法:本研究中，我們隨機(jī)選取了分別于不同時(shí)段(2005年1月-2007年12月，179例，為A組)(2010年2月-2

14、011年12月，110例，為B組)在復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院行根治性手術(shù)切除的兩組肝細(xì)胞肝癌患者，以及另一個(gè)包括慢性肝病、肝臟良性腫瘤、正常健康人及轉(zhuǎn)移性肝癌患者的對(duì)照組。收集其血清樣本，采用酶聯(lián)免疫法ELISA檢測(cè)OPN的水平。A組和對(duì)照組用來確定患者術(shù)前OPN的基線水平;B組患者檢測(cè)了術(shù)前、術(shù)后1周、術(shù)后1月及術(shù)后超過2月的OPN水平，用來分析患者術(shù)后OPN的動(dòng)態(tài)變化。
　　結(jié)果:A組術(shù)前血清OPN的基線水平為164.3±18.6

15、ng/mL與B組的基本一致，兩組OPN的水平明顯高于對(duì)照組中的慢性肝病(p＜0.0001)、轉(zhuǎn)移性肝癌(p＜0.0001)以及肝臟良性腫瘤(p＜0.0001)的患者。在B組中術(shù)后1周的血清OPN水平(214.4±14.1 ng/mL)明顯高于術(shù)前水平，但在術(shù)后1月時(shí)回落到近似于慢性肝病組水平(47.6±5.4 ng/mL)，術(shù)后2月下降到最低值(36.3±5.9ng/mL)。肝癌復(fù)發(fā)時(shí)，血清OPN水平再次升高，而當(dāng)復(fù)發(fā)的腫瘤再次被手術(shù)切

16、除后，OPN水平又開始下降，呈現(xiàn)與第一次手術(shù)后一致的現(xiàn)象。而且無論在甲胎蛋白(AFP)陰性或陽(yáng)性的患者中都呈現(xiàn)這一變化模式。術(shù)后血清OPN水平與肝功能及C反應(yīng)蛋白水平相關(guān)。
　　結(jié)論:肝癌患者血清術(shù)前OPN水平較對(duì)照明顯升高，并在術(shù)后經(jīng)短暫升高后約5周后逐漸下降;當(dāng)肝癌復(fù)發(fā)時(shí)血清OPN再次升高并且AFP陰性患者也有此規(guī)律，因此肝癌術(shù)后血清OPN變化可以作為肝癌根治術(shù)后病程觀察和監(jiān)測(cè)復(fù)發(fā)的依據(jù)。
　　全文總結(jié)
　　1.經(jīng)

17、驗(yàn)證優(yōu)化后，基于肝癌組織的5基因的預(yù)測(cè)模型能較為準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)，癌旁組織中的5基因的預(yù)測(cè)模型能較為準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)肝癌術(shù)后生存，經(jīng)大樣本前瞻性驗(yàn)證具有臨床應(yīng)用價(jià)值。
　　2.肝癌患者血清術(shù)前OPN水平較正常人及肝硬化患者明顯升高，并在術(shù)后經(jīng)短暫升高后約5周逐漸下降;當(dāng)肝癌復(fù)發(fā)時(shí)血清OPN再次升高并且AFP陰性患者也有此規(guī)律，肝癌術(shù)后血清OPN變化可以作為肝癌根治術(shù)后病程觀察和監(jiān)測(cè)復(fù)發(fā)的依據(jù)。
　　創(chuàng)新點(diǎn)
　　1.驗(yàn)證

18、優(yōu)化整合得出穩(wěn)定的基于癌與癌旁組織的肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)預(yù)測(cè)模型。
　　2.開發(fā)并組裝了預(yù)測(cè)肝癌術(shù)后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)與生存的實(shí)時(shí)定量PCR微陣列芯片試劑盒。
　　3.首次報(bào)道肝癌患者血清OPN可替代AFP作為肝癌術(shù)后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的檢測(cè)指標(biāo)。
　　潛在應(yīng)用價(jià)值
　　1.優(yōu)化驗(yàn)證整合癌組織153基因模型和癌周17個(gè)免疫因子預(yù)測(cè)模型，得出確實(shí)可信、實(shí)用的模型，向臨床轉(zhuǎn)化邁出了堅(jiān)實(shí)的一步。
　　2.本研究中已經(jīng)申請(qǐng)國(guó)家專利2項(xiàng):“預(yù)測(cè)