人工TALEN核酸酶與基因打靶載體的構(gòu)建.pdf

1、研究背景與目的:鼻咽癌（NPC）是我國南方常見的惡性腫瘤之一，是一種遺傳和環(huán)境因素共同作用的多基因遺傳性腫瘤。通過大量對鼻咽癌的研究，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)受多基因調(diào)控，因此多基因聯(lián)合治療對于控制鼻咽癌的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)有重要的意義。該國家自然基金項(xiàng)目的總體目標(biāo)就是建立多基因聯(lián)合干預(yù)鼻咽癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的技術(shù)平臺，本論文為該目標(biāo)的前期工作，即構(gòu)建人工TALEN核酸酶與基因打靶載體。
　　基因打靶技術(shù)是近幾十年新興的遺傳操作手段，已被證明是

2、目前精確修飾基因組的最有效方法之一。至今，該技術(shù)引起了人們廣泛的關(guān)注并逐漸走向成熟，為基因治療疾病掀開了新的一面。然而，傳統(tǒng)的基因打靶發(fā)生同源重組事件的概率僅僅是10-6-10-5之間。為了解決利用基因打靶技術(shù)使基因治療在臨床應(yīng)用過程中所面臨的問題，課題組前期已建立鋅指核酸酶（ZFNs）與以rDNA間隔序列作為靶位點(diǎn)的多位點(diǎn)基因打靶相結(jié)合的新型技術(shù)，并證明該技術(shù)能有效的提高定點(diǎn)整合率和外源基因的穩(wěn)定表達(dá)。
　　最近，類轉(zhuǎn)錄激活因子

3、樣效應(yīng)因子核酸酶（TALENs）由于其定點(diǎn)插入效率高、細(xì)胞毒性低的特點(diǎn)引起了人們的注意。TALENs主要包含兩個結(jié)構(gòu)域，分別是DNA識別結(jié)構(gòu)域TALE蛋白和由非特異核酸內(nèi)切酶FokⅠ組成的DNA切割結(jié)構(gòu)域。與ZFNs對基因組DNA的切割機(jī)制一樣，TALENs是由兩個單體以尾對尾的方式通過TALE蛋白特異性結(jié)合到靶DNA后，非特異性內(nèi)切酶FokⅠ形成二聚體切割靶DNA序列的，造成靶序列DNA雙鏈斷裂（DSB）。在同源臂DNA模板存在下，D

4、SB被同源重組（HR）介導(dǎo)的修復(fù)機(jī)制準(zhǔn)確的修復(fù)。因此，我們利用TALENs技術(shù)與多位點(diǎn)打靶技術(shù)相結(jié)合，將有效提高基因定點(diǎn)插入效率。
　　本文擬構(gòu)建人基因組rDNA基因序列上的TALENs真核表達(dá)載體，并通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染及基因測序篩選出最高切割活性的一對TALENs。同時，采用基因克隆技術(shù)構(gòu)建人類通用構(gòu)建多位點(diǎn)打靶載體。TALENs和多位點(diǎn)打靶技術(shù)的結(jié)合，是一種有效基因組編輯新技術(shù)，將為鼻咽癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的多基因調(diào)控建立關(guān)鍵技術(shù)并提供重要材

5、料。
　　方法:
　　一、運(yùn)用在線軟件在人基因組rDNA基因序列上尋找到合適的TALENs切割位點(diǎn)，利用TALENs單體和骨架質(zhì)粒庫，構(gòu)建5條TALENs真核表達(dá)載體，并通過酶切、測序比對加以驗(yàn)證。TALENs載體經(jīng)配對，以最優(yōu)轉(zhuǎn)染體系條件轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞，經(jīng)適當(dāng)濃度的嘌呤霉素篩選4 d后提取基因組DNA，PCR擴(kuò)增靶序列，經(jīng)測序峰圖判斷TALENs活性，并選出切割活性最高的一對TALENs。經(jīng)PCR產(chǎn)物克隆pMD1

6、9-T載體后，挑取25-30個質(zhì)粒進(jìn)行測序，質(zhì)粒測序結(jié)果經(jīng)比對，判斷該對TALENs對靶位點(diǎn)的切割活性。
　　二、以TALENs切割位點(diǎn)為靶位點(diǎn)構(gòu)建人類細(xì)胞通用多位點(diǎn)基因打靶載體。該打靶載體包含左右同源重組引導(dǎo)序列DS1和DS2（TALENs切割位點(diǎn)兩側(cè)基因序列）以及標(biāo)記蛋白表達(dá)元件。采用基因克隆方法將DS1、DS2、標(biāo)記蛋白表達(dá)元件克隆至pUC-19載體中。最終，經(jīng)酶切、測序以及將載體轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞觀察是否表達(dá)得到驗(yàn)證。

7、r>　　結(jié)果:
　　一、5條TALENs真核表達(dá)載體經(jīng)酶切證實(shí)片段大小與預(yù)期一致，測序結(jié)果經(jīng)過氨基酸比對該載體與片段完全匹配，成功構(gòu)建5條TALENs真核表達(dá)載體。其中兩條為TALENs左臂L1、L2，三條為TALENs右臂R1、R2、R3。將不同配伍的TALENs轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，根據(jù)基因測序峰圖發(fā)現(xiàn)TALENs-L1R2峰圖出現(xiàn)明顯套峰，經(jīng)質(zhì)粒測序結(jié)果比對，發(fā)現(xiàn)TALENs-L1R2對靶位點(diǎn)的切割活性可達(dá)78.5％。

8、　　二、重組質(zhì)粒pUC-DS1-EGFP-DS2經(jīng)酶切及菌液PCR驗(yàn)證該插入片段大小與預(yù)期一致，測序結(jié)果顯示該插入片段與目的片段匹配，成功構(gòu)建多位點(diǎn)打靶載體pUC-DS1-EGFP-DS2；經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)染驗(yàn)證，證明pUC-DS1-EGFP-DS2中綠色熒光能在細(xì)胞中表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　一、成功設(shè)計(jì)、構(gòu)建5條TALENs真核表達(dá)載體，并得到切割活性最高的TALENs-L1R2。
　　二、成功構(gòu)建人類通用多位點(diǎn)打靶載體pU