Nogo-B對氣道平滑肌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響及其與哮喘的相關(guān)性研究.pdf

1、背景：氣道結(jié)構(gòu)重塑尤其是氣道平滑肌重塑是支氣管哮喘病程中的重要病理改變之一。已有研究顯示這一改變與氣道平滑肌細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移等生物學(xué)特性的異常有關(guān),但具體機(jī)制尚不十分明確。業(yè)已證實(shí),網(wǎng)狀蛋白家族4(Reticular protein family,RTN4)成員中的Nogo-B參與了血管平滑肌細(xì)胞的凋亡、增殖、遷移等生物學(xué)過程。對于具有同樣胚胎起源的氣道平滑肌細(xì)胞(Airway smooth muscle cell, ASMC),

2、Nogo-B在該細(xì)胞中的表達(dá)情況及生物學(xué)作用目前尚未見報(bào)道。因此,探討Nogo-B在氣道平滑肌細(xì)胞中的的表達(dá),進(jìn)一步闡明其對氣道平滑肌細(xì)胞的生物學(xué)功能的影響并揭示其在哮喘氣道結(jié)構(gòu)重塑中所起的作用,具有重要的學(xué)術(shù)價(jià)值。 目的：明確Nogo-B在原代培養(yǎng)的人支氣管平滑肌細(xì)胞表達(dá)情況及其表達(dá)下調(diào)對平滑肌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移等生物學(xué)特性的影響。同時(shí),觀察哮喘相關(guān)炎癥介質(zhì)作用對氣道平滑肌細(xì)胞Nogo-B表達(dá)的影響,以探討Nogo-B在哮喘

3、氣道結(jié)構(gòu)重塑中的可能作用。 方法：一、人支氣管平滑肌細(xì)胞中Nogo-B mRNA及蛋白的表達(dá)情況 選用體外培養(yǎng)的原代人支氣管平滑肌細(xì)胞,以Hela細(xì)胞作為陽性對照,先提取細(xì)胞總RNA及蛋白,然后通過RT-PCR及Western Blotting等方法觀察了支氣管平滑肌細(xì)胞中Nogo-B mRNA及蛋白表達(dá)情況。 二、下調(diào)Nogo-B表達(dá)對氣道平滑肌細(xì)胞增殖、凋亡和遷移的影響 (一)在采用陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的

4、siRNA干擾的方法下調(diào)入支氣管平滑肌細(xì)胞Nogo-B的表達(dá)后,檢測各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞總數(shù)(CCK-8法),并比較其差異,以評價(jià)Nogo-B表達(dá)下調(diào)對人支氣管平滑肌細(xì)胞增殖的影響。 (二)在采用siRNA干擾的方法有效下調(diào)了人支氣管平滑肌細(xì)胞Nogo-B的表達(dá)后,以TNF-α刺激各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞一定時(shí)間以誘導(dǎo)凋亡,然后采用Annexin V/PI雙染法于流式細(xì)胞儀上計(jì)數(shù)各實(shí)驗(yàn)組早期凋亡的細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的比例,以評價(jià)Nogo-B表達(dá)下調(diào)對T

5、NF-α誘導(dǎo)的人支氣管平滑肌細(xì)胞凋亡的影響。 (三)將人支氣管平滑肌細(xì)胞接種于Millicell小室中,繼而采用siRNA干擾的方法下調(diào)細(xì)胞Nogo-B的表達(dá)。在RNA干擾起效后,通過調(diào)高M(jìn)illicell小室外室的血清濃度以開始細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。通過檢測各實(shí)驗(yàn)組發(fā)生遷移的細(xì)胞總數(shù),以評價(jià)Nogo-B表達(dá)下調(diào)對人支氣管平滑肌細(xì)胞遷移的影響。 三、哮喘相關(guān)炎癥介質(zhì)對氣道平滑肌細(xì)胞Nogo-B表達(dá)的影響 在完成上述實(shí)驗(yàn)的

6、基礎(chǔ)上,選擇哮喘相關(guān)的炎癥介質(zhì)IL-4、IL-13,分別以IL-4(10ng/ml)、IL-13(10ng/ml)及兩者的組合(各10ng/ml)刺激體外培養(yǎng)的原代人支氣管平滑肌細(xì)胞,采用Realtime PCR及Western Blotting等方法分別檢測不同時(shí)間點(diǎn)mRNA及蛋白表達(dá)的變化,以評價(jià)哮喘相關(guān)炎癥介質(zhì)對支氣管平滑肌細(xì)胞Nogo-B表達(dá)的影響。 結(jié)果：一、人支氣管平滑肌細(xì)胞中Nogo-B mRNA及蛋白的表達(dá)情況

7、 提取人支氣管平滑肌細(xì)胞及Hela細(xì)胞的總RNA及蛋白后,rt-PCR結(jié)果顯示在300bp處Hela細(xì)胞及人支氣管平滑肌細(xì)胞均可見Nogo-B mRNA特異性條帶表達(dá)。而Western Blotting顯示在約37kD處,人支氣管平滑肌細(xì)胞及Hela細(xì)胞均可見Nogo-B蛋白表達(dá)。從而證實(shí)人支氣管平滑肌細(xì)胞中存在Nogo-B的表達(dá)。 二、下調(diào)Nogo-B表達(dá)對人支氣管平滑肌細(xì)胞增殖、凋亡和遷移的影響 (一)采用si

8、RNA干擾下調(diào)人支氣管平滑肌細(xì)胞中Nogo-B表達(dá)后72小時(shí),細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示(CCK-8法),與陰性siRNA對照組比,Nogo-B表達(dá)下調(diào)組細(xì)胞數(shù)高于陰性對照組,但兩者無顯著性差異。(Nogo-B表達(dá)下調(diào)組1.244±0.188,陰性對照組1.1974±0.114,P＞0.05)。提示Nogo-B表達(dá)下調(diào)對人支氣管平滑肌細(xì)胞的增殖無明顯影響。 (二)在采用siRNA干擾下調(diào)入支氣管平滑肌細(xì)胞Nogo-B表達(dá)的基礎(chǔ)上,Anne

9、xin-V/PI雙染法結(jié)果顯示TNF-a處理前后Nogo-B表達(dá)下調(diào)組凋亡細(xì)胞增加數(shù)明顯低于陰性對照組,兩者有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(陰性對照組9.65±0.42％,Nogo-B表達(dá)下調(diào)組0.02±0.11％,P＜0.01)。提示Nogo-B表達(dá)下調(diào)可減少TNF-a誘導(dǎo)的支氣管平滑肌細(xì)胞凋亡。 (三)在采用siRNA干擾下調(diào)人支氣管平滑肌細(xì)胞Nogo-B表達(dá)的基礎(chǔ)上,分別對Nogo-B下調(diào)組、陰性siRNA對照組發(fā)生遷移的細(xì)胞總數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù),

10、結(jié)果顯示,與陰性siRNA對照組相比,Nogo-B表達(dá)下調(diào)組減少了4.4倍,兩者有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(陰性對照組0.616±0.04,Nogo-B表達(dá)下調(diào)組0.164±0.006,P＜0.01)。提示Nogo-B表達(dá)下調(diào)可抑制人支氣管平滑肌細(xì)胞的遷移功能。 三、哮喘相關(guān)炎癥介質(zhì)對氣道平滑肌細(xì)胞Nogo-B表達(dá)的影響 (一)IL-4(10ng/ml)、IL-13(10ng/ml)單獨(dú)刺激24小時(shí)未能使人支氣管平滑肌細(xì)胞中Nogo-

11、B的表達(dá)水平發(fā)生顯著變化,而IL-4和IL-13(各 10ng/ml)共同作用后,Nogo-B mRNA表達(dá)出現(xiàn)降低,其中1h時(shí)表達(dá)量較Oh基礎(chǔ)值下降約7倍(相對CT值：0小時(shí)1,1小時(shí)0.136±0.009,P＜0.01),隨著時(shí)間推移其表達(dá)逐漸恢復(fù)。且IL-4、IL-13共同作用12小時(shí)后,人支氣管平滑肌細(xì)胞中Nogo-B蛋白表達(dá)開始下降,至24小時(shí)時(shí)下降最為明顯,各時(shí)間點(diǎn)的空白對照無明顯變化。提示Nogo-B可能作為哮喘氣道炎癥導(dǎo)