不同濃度脂多糖對哮喘大鼠氣道平滑肌細(xì)胞合成分泌功能的影響及其機(jī)制的研究.pdf

1、目的:我們將通過建立哮喘大鼠模型,從細(xì)胞水平及整體動物水平研究不同濃度脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激哮喘大鼠氣道平滑肌細(xì)胞(Airway smooth muscle cells,ASMCs)誘導(dǎo)TLR4信號通路激活,對哮喘大鼠ASMCs合成分泌的影響及其機(jī)制。
　　方法:用卵清蛋白(OVA)致敏并激發(fā)建立大鼠哮喘模型,分離哮喘大鼠ASMCs進(jìn)行原代培養(yǎng),用不同濃度LPS刺激及抗TLR4抗體阻斷TLR4。

2、采用酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)檢測大鼠 ASMCs培養(yǎng)上清液分泌細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4的情況,逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測大鼠ASMCs中TLR4mRNA的表達(dá)水平,從而對體外培養(yǎng)的ASMCs在不同濃度LPS刺激后的分泌細(xì)胞因子的情況及TLR4表達(dá)水平進(jìn)行研究;本課題還通過建立大鼠哮喘模型,用不同濃度LPS對大鼠進(jìn)行干預(yù)刺激,采用蘇木素伊紅(HE)染色觀察大鼠肺組織病理改變,RT-PCR法檢測大鼠氣道平滑肌TLR

3、4mRNA的表達(dá)水平,探討不同濃度LPS對哮喘大鼠氣道炎癥及氣道重塑的影響。
　　1.結(jié)果(第一部分實(shí)驗(yàn))
　　(1)ELISA法檢測各組哮喘大鼠ASMCs分泌細(xì)胞因子:低濃度LPS組(B)IL-4蛋白含量高于空白對照組(A)(P﹤0.01),IFN-γ蛋白含量與空白對照組(A)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);高濃度LPS組(C) IL-4蛋白含量低于空白對照組(A)(P﹤0.01),IFN-γ蛋白含量高于空白對照組(

4、A)(P﹤0.01);低濃度LPS組(B)IL-4蛋白含量高于高濃度LPS組(C)(P﹤0.01),IFN-γ蛋白含量低于高濃度LPS組(C)(P﹤0.01);低濃度LPS+TLR4抗體組(D)IL-4蛋白含量低于低濃度LPS組(B)(P﹤0.01),IFN-γ蛋白含量與低濃度 LPS組(B)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),分別與空白對照組(A)IL-4、IFN-γ含量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);高濃度LPS+TLR4抗

5、體組(E)IL-4蛋白含量高于高濃度LPS組(C)(P﹤0.01),IFN-γ蛋白含量低于高濃度LPS組(B)(P﹤0.01),分別與空白對照組(A)IL-4、IFN-γ含量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　(2)RT-PCR檢測各組哮喘大鼠ASMCs中TLRmRNA表達(dá)水平:低濃度LPS組(B)、高濃度LPS組(C)TLR4 mRNA表達(dá)水平高于空白對照組(A)(P﹤0.01);高濃度 LPS組(C)TLR4 mRNA

6、表達(dá)水平高于低濃度 LPS組(B)(P﹤0.05);低濃度LPS+TLR4抗體組(D)、高濃度LPS+TLR4抗體組(E)TLR4 mRNA表達(dá)水平低于空白對照組(A)(P﹤0.01);低濃度 LPS+TLR4抗體組(D)TLR4 mRNA表達(dá)水平低于低濃度LPS組(B)(P﹤0.01);高濃度LPS+TLR4抗體組(E)TLR4 mRNA表達(dá)水平低于高濃度LPS組(C)(P﹤0.01)。
　　2.結(jié)果(第二部分實(shí)驗(yàn))
　　

7、(1)HE染色觀察:哮喘組(A組)可見支氣管、肺泡及肺間質(zhì)充斥大量炎癥細(xì)胞,支氣管壁增厚、粘膜層腫脹充血、皺折增多,平滑肌增厚,管腔狹窄。低濃度LPS組(B組)上述炎癥改變無明顯減輕。高濃度LPS組(C組)上述癥狀明顯減輕。正常對照組(D組)肺組織結(jié)構(gòu)正常,無明顯炎癥表現(xiàn)。
　　(2)支氣管壁厚度(WAt/Pi)、支氣管壁平滑肌厚度(WAm/Pi)、支氣管壁平滑肌細(xì)胞核數(shù)量(N/Pi):哮喘組(A組)、低濃度LPS組(B組)及高濃

8、度LPS組(C組)支氣管壁厚度(WAt/Pi)、支氣管壁平滑肌厚度(WAm/Pi)、支氣管壁平滑肌細(xì)胞核數(shù)量(N/Pi)均顯著高于正常對照組(D組)(P<0.01);低濃度 LPS組( B組)支氣管壁厚度(WAt/Pi)、支氣管壁平滑肌厚度(WAm/Pi)、支氣管壁平滑肌細(xì)胞核數(shù)量(N/Pi)顯著高于哮喘組( A組)(P<0.01),高濃度LPS組(C組)支氣管壁厚度(WAt/Pi)、支氣管壁平滑肌厚度(WAm/Pi)、支氣管壁平滑肌細(xì)

9、胞核數(shù)量(N/Pi)顯著低于哮喘組(A組)(P<0.01)。
　　(3)各組大鼠氣道阻力比較發(fā)現(xiàn):哮喘組(A組)、低濃度LPS組(B組)、高濃度LPS組(C組)氣道阻力均明顯高于正常對照組(D組)(P<0.01);高濃度LPS組(C組)氣道阻力顯著低于哮喘組(A組)(P<0.01),低濃度LPS組(B組)與哮喘組(A組)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);高濃度LPS組(C組)氣道阻力明顯低于低濃度LPS組(B組)(P<0.01

10、)。
　　(4)RT-PCR檢測各組哮喘大鼠氣道平滑肌中TLRmRNA表達(dá)水平:哮喘組(A組)、低濃度LPS組(B組)、高濃度LPS組(C組)明顯高于正常對照組(D組)(P﹤0.01);低濃度LPS組(B組)、高濃度LPS組(C組)氣道平滑肌TLR4mRNA表達(dá)水平明顯高于哮喘組(A組)(P<0.01);高濃度LPS組(C組)氣道平滑肌TLR4mRNA表達(dá)水平明顯高于低濃度LPS組(B組)(P<0.05)。
　　結(jié)論: