Toll樣受體4對(duì)哮喘氣道平滑肌細(xì)胞的合成分泌及增殖凋亡的作用研究.pdf

1、研究背景和目的: 支氣管哮喘(簡(jiǎn)稱(chēng)哮喘)(bronchial asthma)是由多種細(xì)胞(如嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞等)和細(xì)胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病。其重要的病理特征是慢性氣道炎癥和氣道重構(gòu)。慢性炎癥是以多細(xì)胞及細(xì)胞組分參與的免疫反應(yīng);氣道重構(gòu)以氣道平滑肌細(xì)胞(Airway smooth muscle cells, ASMCs)增生肥大、粘液腺增生、基底膜增厚、粘膜化生和新生血管的增生等為特征;

2、但目前氣道炎癥和氣道重構(gòu)的機(jī)制未完全明確。近年的研究表明:氣道平滑肌細(xì)胞不僅作為靶細(xì)胞參與氣道重構(gòu),還作為免疫細(xì)胞參與氣道炎癥反應(yīng),因此,氣道平滑肌細(xì)胞在哮喘的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起著重要作用。
　　Toll樣受體(Toll like receptors, TLRs)是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的高度保守而古老的天然免疫受體家族,它介導(dǎo)固有免疫和獲得性免疫,可促使多種炎癥因子和細(xì)胞因子釋放,引發(fā)和加重炎癥反應(yīng)。國(guó)外的研究報(bào)道 Toll樣受體4(Tol

3、l like receptors4,TLR4)在氣道平滑肌細(xì)胞有表達(dá),同時(shí)也證實(shí)外周血單核細(xì)胞與正常氣道平滑肌細(xì)胞共同培養(yǎng)條件下,Toll樣受體2(Toll like receptors2,TLR2)及TLR4配體可誘導(dǎo)氣道平滑肌細(xì)胞產(chǎn)生、釋放細(xì)胞因子、趨化因子,但國(guó)內(nèi)未見(jiàn)TLRs與氣道平滑肌細(xì)胞關(guān)系的研究報(bào)道;而且國(guó)外的研究?jī)H局限于正常氣道平滑肌細(xì)胞表面 TLRs激活與其分泌功能的關(guān)系并未涉及哮喘狀態(tài)下氣道平滑肌細(xì)胞的TLRs的作用研

4、究。
　　Sraat等人證實(shí)了激活TLR4可以促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的增殖,氣道平滑肌細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞都屬于平滑肌細(xì)胞,在形態(tài)和功能上非常相似,因此,我們推測(cè)哮喘氣道炎癥中的眾多炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子可激活A(yù)SMCs細(xì)胞膜上的 TLRs,TLRs結(jié)合不同配體誘導(dǎo)哮喘氣道平滑肌細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)、釋放炎癥介質(zhì)及促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制凋亡,從而在哮喘的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起重要作用。
　　NF-ΚB是一種重要的、多向性的核轉(zhuǎn)錄因子,普遍存在于

5、細(xì)胞質(zhì)中的快速反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子,位于TLRs下游信號(hào)通路的樞紐位置參與免疫反應(yīng)及細(xì)胞增殖與分化等過(guò)程。
　　哮喘治療指南推薦糖皮質(zhì)激素作為首選治療氣道炎癥,地塞米松是一經(jīng)典的糖皮質(zhì)激素抗炎藥,但其作用機(jī)制未明,因此,我們選用地塞米松治療哮喘大鼠,探討TLR4/NF-ΚB對(duì)哮喘大鼠氣道重構(gòu)的影響。
　　綜上所述,我們將建立大鼠哮喘模型,取肺組織,用圖象分析軟件測(cè)量氣道壁厚度,分離氣道平滑肌細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)、利用RNAi技術(shù)這一基因

6、沉默技術(shù)將TLR4基因沉默以及RT-PCR、Western blot、TUNNEL、ELISA等方法探討 TLR4對(duì)哮喘狀態(tài)下氣道平滑肌細(xì)胞的合成分泌功能及增殖凋亡的影響。為哮喘氣道炎癥和氣道重構(gòu)的發(fā)生機(jī)制提供新的理論,為尋找支氣管哮喘治療的新藥物和新靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。
　　方法: 本課題采用細(xì)胞培養(yǎng)、siRNA干擾技術(shù)、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、免疫組織化學(xué)染色、免疫細(xì)胞化學(xué)染色、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)、Western印跡、酶聯(lián)免

7、疫吸附測(cè)定(ELISA)法、四甲基偶氮唑鹽(MTT)微量比色法及TUNNEL等檢測(cè)方法,用腫瘤壞死因子-α(Tumor necosis factor-α,TNF-α)、NF-кB抑制劑二硫代氨基甲酸吡咯烷(PDTC)作為工具藥,對(duì)體外培養(yǎng)的哮喘大鼠氣道平滑肌細(xì)胞中TLR4調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡、合成分泌功能及TLR4表達(dá)進(jìn)行研究;本課題還通過(guò)建立大鼠哮喘模型,采用Western印跡檢測(cè)TLR4的蛋白表達(dá)水平、RT-PCR等方法檢測(cè)TLR4的

8、mRNA表達(dá)水平,免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、凋亡調(diào)節(jié)蛋白 Bcl-2的表達(dá)水平,通過(guò)圖像分析系統(tǒng)測(cè)定支氣管壁厚度(WA/pi)、支氣管壁平滑肌厚度(平滑肌面積/pi)、支氣管壁平滑肌細(xì)胞核數(shù)量(N/pi),對(duì) TLR4在哮喘大鼠氣道平滑肌重構(gòu)中的作用進(jìn)行研究。
　　1.結(jié)果:
　　(1)哮喘組ASMCs增殖反應(yīng)明顯高于正常組(P<0.01);哮喘組ASMCs培養(yǎng)上清中IL-5、IL-8的蛋白含量明顯高于

9、正常組(P<0.01)。
　　(2)siRNA-TLR4轉(zhuǎn)染哮喘大鼠氣道平滑肌細(xì)胞的最佳時(shí)間為24h。
　　2.1結(jié)果
　　(1)siRNA-TLR4轉(zhuǎn)染組的ASMCs增殖反應(yīng)顯著低于對(duì)照組(P<0.05);TNF-α組 ASMCs增殖反應(yīng)顯著高于對(duì)照組、siRNA-TLR4轉(zhuǎn)染組、TNF-α+siRNA-TLR4轉(zhuǎn)染組(P均<0.01)。
　　(2)siRNA-TLR4轉(zhuǎn)染組和TNF-α+siRNA-TLR4轉(zhuǎn)

10、染組細(xì)胞凋亡率顯著高于對(duì)照組(P均<0.01); TNF-α組 ASMCs的凋亡率顯著低于對(duì)照組、siRNA-TLR4轉(zhuǎn)染組、TNF-α+siRNA-TLR4轉(zhuǎn)染組(P均<0.01)。
　　(3)對(duì)照組和TNF-α組IL-5、IL-8蛋白含量顯著高于siRNA-TLR4轉(zhuǎn)染組和TNF-α+siRNA-TLR4轉(zhuǎn)染組(P均<0.01);TNF-α+siRNA-TLR4轉(zhuǎn)染組IL-5、IL-8蛋白含量顯著高于SiRNA-TLR4轉(zhuǎn)染組

11、(P均<0.01);TNF-α組蛋白含量顯著高于對(duì)照組、siRNA-TLR4轉(zhuǎn)染組、TNF-α+siRNA-TLR4轉(zhuǎn)染組(P均<0.01)。
　　(4)對(duì)照組和 TNF-α組 TLR4的 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著高于siRNA-TLR4轉(zhuǎn)染組、TNF-α+siRNA-TLR4轉(zhuǎn)染組(P均<0.01);TNF-α組TLR4的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組;siRNA-TLR4轉(zhuǎn)染組與TNF-α組之間無(wú)顯著差異(P>0.05

12、)。
　　2.2結(jié)果
　　(1)TNF-α組ASMCs的增殖反應(yīng)與對(duì)照組相比有顯著差異(P<0.05), TNF-α+PDTC組、TNF-α+TLR4抗體組ASMCs增殖反應(yīng)顯著低于TNF-α處理組(P<0.01),TNF-α+PDTC組與對(duì)照組相比差異無(wú)顯著性(P>0.05),TNF-α+TLR4抗體組ASMCs增殖反應(yīng)顯著低于對(duì)照組(P<0.01)。
　　(2) TNF-α處理組細(xì)胞凋亡率顯著低于對(duì)照組(P<0.0

13、1)。TNF-α+PDTC組、TNF-α+TLR4抗體組細(xì)胞凋亡率顯著高于TNF-α組、對(duì)照組(P均<0.01)。(3)TNF-α組NF-ΚB、IL-5、IL-8蛋白含量顯著高于對(duì)照組、TNF-α+PDTC組及TNF-α+TLR4抗體組(P均<0.01);TNF-α+PDTC組與TNF-α+TLR4抗體組之間差異無(wú)顯著性(P>0.05)。
　　(4)TNF-α組TLR4mRNA表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組及TNF-α+TLR4抗體組(P

14、均<0.01);TNF-α+TLR4抗體組TLR4表達(dá)水平與對(duì)照組之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。
　　(5)TNF-α組TLR4蛋白表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組及TNF-α+TLR4抗體組(P均<0.01);對(duì)照組 TLR4表達(dá)水平顯著高于 TNF-α+TLR4抗體組(P<0.01).
　　3結(jié)果
　　(1)哮喘4周組、哮喘8周組的氣道壁 EOS計(jì)數(shù)均較正常對(duì)照組顯著增加(P<0.01),且隨哮喘天數(shù)的增加 EOS計(jì)數(shù)也

15、有增加的趨勢(shì),且兩組間比較差異有顯著性(P<0.05)。地塞米松治療4周組與哮喘4周組相比較低,有顯著差異(P<0.05),地塞米松治療8周組較哮喘4周組、哮喘8周組、地塞米松治療4周組相比較低,有顯著差異(P<0.01),但與正常對(duì)照組相比仍較高(P<0.01),治療8周組較治療4周組相比較低,有顯著差異(P<0.05)
　　(2)哮喘4周組及哮喘8周組支氣管壁厚度(WA/pi)、支氣管壁平滑肌厚度(平滑肌的面積/pi)、支氣管

16、壁平滑肌細(xì)胞核數(shù)量(N/pi)均較正常對(duì)照組明顯增加(P<0.01),且隨哮喘天數(shù)的增加上述指標(biāo)亦有增加趨勢(shì),哮喘8周組較哮喘4周組明顯增加(P<0.01);治療4周組與哮喘4周組、治療8周組與哮喘8周組相比顯著降低(P<0.01),但治療組與正常組相比仍較高(P<0.01)。(3)哮喘4周組、哮喘8周組的氣道反應(yīng)性均高于正常對(duì)照組(P<0.01)。治療4周組氣道反應(yīng)性較哮喘4周組下降,有差異(P<0.05),哮喘8周組氣道反應(yīng)性較哮喘

17、4周組明顯增高(P<0.01)。治療8周組氣道反應(yīng)性較哮喘4周組、哮喘6周組、治療4周組均顯著降低(均為 P<0.01),但仍高于正常對(duì)照組(P<0.01)。
　　(4)哮喘4周組、哮喘8周組的TLR4及NF-ΚB的mRNA水平明顯高于地塞米松治療4周組、地塞米松治療8周組及對(duì)照組(P<0.01);TLR4及NF-ΚB的mRNA水平隨哮喘天數(shù)的增加而明顯增加(P<0.01);地塞米松治療4周組的 TLR4及 NF-ΚB的 mRNA

18、水平明顯高于地塞米松治療8周組(P<0.05)。
　　(5)哮喘4周組、哮喘8周組的TLR4蛋白質(zhì)表達(dá)明顯高于地塞米松治療4周組、地塞米松治療8周組及對(duì)照組(P<0.01);哮喘8周組的TLR4蛋白質(zhì)表達(dá)高于哮喘4周組(P<0.05), TLR4蛋白水平隨哮喘天數(shù)的增加而明顯增加;地塞米松治療8周組TLR4蛋白質(zhì)表達(dá)高于對(duì)照組(P<0.05)。
　　(6)哮喘4周組、哮喘8周組 PCNA的蛋白表達(dá)量均明顯高于正常對(duì)照組(P<

19、0.01),且哮喘兩組間上述指標(biāo)差異有顯著性(P<0.05);地塞米松治療8周組PCNA的蛋白表達(dá)量明顯低于哮喘4周組、哮喘8周組及地塞米松治療4周。哮喘4周組、哮喘8周組及地塞米松治療4周組Bcl-2的蛋白表達(dá)量與對(duì)照組相比明顯增高(P<0.01);地塞米松治療4周Bcl-2的蛋白表達(dá)明顯高于地塞米松治療8周(P<0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、siRNA-TLR4轉(zhuǎn)染哮喘大鼠ASMCs的最佳轉(zhuǎn)染時(shí)間是24小時(shí)。

20、　　2、TLR4可能參與調(diào)控哮喘大鼠氣道平滑肌細(xì)胞的增殖、凋亡和IL-5、IL-8合成、分泌,從而參與氣道重構(gòu)和氣道炎癥的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。
　　3、TLR4可能通過(guò) NF-ΚB傳遞生物信號(hào)調(diào)控哮喘大鼠氣道平滑肌細(xì)胞的增殖、凋亡和合成、分泌,在哮喘的氣道重構(gòu)和氣道炎癥中起重要作用。
　　4、TLR4可能通過(guò) NF-ΚB參與哮喘大鼠模型的氣道平滑肌增殖凋亡的調(diào)控,地塞米松可能通過(guò)抑制TLR4表達(dá),下調(diào)NF-ΚB活性抑制細(xì)胞增殖反