Toll樣受體4對哮喘氣道平滑肌細胞的合成分泌及增殖凋亡的作用研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、研究背景和目的: 支氣管哮喘(簡稱哮喘)(bronchial asthma)是由多種細胞(如嗜酸性粒細胞、肥大細胞、T淋巴細胞、中性粒細胞、氣道上皮細胞等)和細胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病。其重要的病理特征是慢性氣道炎癥和氣道重構。慢性炎癥是以多細胞及細胞組分參與的免疫反應;氣道重構以氣道平滑肌細胞(Airway smooth muscle cells, ASMCs)增生肥大、粘液腺增生、基底膜增厚、粘膜化生和新生血管的增生等為特征;

2、但目前氣道炎癥和氣道重構的機制未完全明確。近年的研究表明:氣道平滑肌細胞不僅作為靶細胞參與氣道重構,還作為免疫細胞參與氣道炎癥反應,因此,氣道平滑肌細胞在哮喘的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用。
  Toll樣受體(Toll like receptors, TLRs)是一個新發(fā)現的高度保守而古老的天然免疫受體家族,它介導固有免疫和獲得性免疫,可促使多種炎癥因子和細胞因子釋放,引發(fā)和加重炎癥反應。國外的研究報道 Toll樣受體4(Tol

3、l like receptors4,TLR4)在氣道平滑肌細胞有表達,同時也證實外周血單核細胞與正常氣道平滑肌細胞共同培養(yǎng)條件下,Toll樣受體2(Toll like receptors2,TLR2)及TLR4配體可誘導氣道平滑肌細胞產生、釋放細胞因子、趨化因子,但國內未見TLRs與氣道平滑肌細胞關系的研究報道;而且國外的研究僅局限于正常氣道平滑肌細胞表面 TLRs激活與其分泌功能的關系并未涉及哮喘狀態(tài)下氣道平滑肌細胞的TLRs的作用研

4、究。
  Sraat等人證實了激活TLR4可以促進血管平滑肌細胞的增殖,氣道平滑肌細胞和血管平滑肌細胞都屬于平滑肌細胞,在形態(tài)和功能上非常相似,因此,我們推測哮喘氣道炎癥中的眾多炎癥介質、細胞因子可激活ASMCs細胞膜上的 TLRs,TLRs結合不同配體誘導哮喘氣道平滑肌細胞產生炎癥反應、釋放炎癥介質及促進細胞增殖、抑制凋亡,從而在哮喘的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用。
  NF-ΚB是一種重要的、多向性的核轉錄因子,普遍存在于

5、細胞質中的快速反應轉錄因子,位于TLRs下游信號通路的樞紐位置參與免疫反應及細胞增殖與分化等過程。
  哮喘治療指南推薦糖皮質激素作為首選治療氣道炎癥,地塞米松是一經典的糖皮質激素抗炎藥,但其作用機制未明,因此,我們選用地塞米松治療哮喘大鼠,探討TLR4/NF-ΚB對哮喘大鼠氣道重構的影響。
  綜上所述,我們將建立大鼠哮喘模型,取肺組織,用圖象分析軟件測量氣道壁厚度,分離氣道平滑肌細胞進行細胞培養(yǎng)、利用RNAi技術這一基因

6、沉默技術將TLR4基因沉默以及RT-PCR、Western blot、TUNNEL、ELISA等方法探討 TLR4對哮喘狀態(tài)下氣道平滑肌細胞的合成分泌功能及增殖凋亡的影響。為哮喘氣道炎癥和氣道重構的發(fā)生機制提供新的理論,為尋找支氣管哮喘治療的新藥物和新靶點奠定基礎。
  方法: 本課題采用細胞培養(yǎng)、siRNA干擾技術、脂質體轉染法、免疫組織化學染色、免疫細胞化學染色、逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)、Western印跡、酶聯免

7、疫吸附測定(ELISA)法、四甲基偶氮唑鹽(MTT)微量比色法及TUNNEL等檢測方法,用腫瘤壞死因子-α(Tumor necosis factor-α,TNF-α)、NF-кB抑制劑二硫代氨基甲酸吡咯烷(PDTC)作為工具藥,對體外培養(yǎng)的哮喘大鼠氣道平滑肌細胞中TLR4調控細胞增殖和凋亡、合成分泌功能及TLR4表達進行研究;本課題還通過建立大鼠哮喘模型,采用Western印跡檢測TLR4的蛋白表達水平、RT-PCR等方法檢測TLR4的

8、mRNA表達水平,免疫組織化學染色檢測增殖細胞核抗原(PCNA)、凋亡調節(jié)蛋白 Bcl-2的表達水平,通過圖像分析系統測定支氣管壁厚度(WA/pi)、支氣管壁平滑肌厚度(平滑肌面積/pi)、支氣管壁平滑肌細胞核數量(N/pi),對 TLR4在哮喘大鼠氣道平滑肌重構中的作用進行研究。
  1.結果:
  (1)哮喘組ASMCs增殖反應明顯高于正常組(P<0.01);哮喘組ASMCs培養(yǎng)上清中IL-5、IL-8的蛋白含量明顯高于

9、正常組(P<0.01)。
  (2)siRNA-TLR4轉染哮喘大鼠氣道平滑肌細胞的最佳時間為24h。
  2.1結果
  (1)siRNA-TLR4轉染組的ASMCs增殖反應顯著低于對照組(P<0.05);TNF-α組 ASMCs增殖反應顯著高于對照組、siRNA-TLR4轉染組、TNF-α+siRNA-TLR4轉染組(P均<0.01)。
  (2)siRNA-TLR4轉染組和TNF-α+siRNA-TLR4轉

10、染組細胞凋亡率顯著高于對照組(P均<0.01); TNF-α組 ASMCs的凋亡率顯著低于對照組、siRNA-TLR4轉染組、TNF-α+siRNA-TLR4轉染組(P均<0.01)。
  (3)對照組和TNF-α組IL-5、IL-8蛋白含量顯著高于siRNA-TLR4轉染組和TNF-α+siRNA-TLR4轉染組(P均<0.01);TNF-α+siRNA-TLR4轉染組IL-5、IL-8蛋白含量顯著高于SiRNA-TLR4轉染組

11、(P均<0.01);TNF-α組蛋白含量顯著高于對照組、siRNA-TLR4轉染組、TNF-α+siRNA-TLR4轉染組(P均<0.01)。
  (4)對照組和 TNF-α組 TLR4的 mRNA和蛋白表達水平顯著高于siRNA-TLR4轉染組、TNF-α+siRNA-TLR4轉染組(P均<0.01);TNF-α組TLR4的mRNA和蛋白表達水平顯著高于對照組;siRNA-TLR4轉染組與TNF-α組之間無顯著差異(P>0.05

12、)。
  2.2結果
  (1)TNF-α組ASMCs的增殖反應與對照組相比有顯著差異(P<0.05), TNF-α+PDTC組、TNF-α+TLR4抗體組ASMCs增殖反應顯著低于TNF-α處理組(P<0.01),TNF-α+PDTC組與對照組相比差異無顯著性(P>0.05),TNF-α+TLR4抗體組ASMCs增殖反應顯著低于對照組(P<0.01)。
  (2) TNF-α處理組細胞凋亡率顯著低于對照組(P<0.0

13、1)。TNF-α+PDTC組、TNF-α+TLR4抗體組細胞凋亡率顯著高于TNF-α組、對照組(P均<0.01)。(3)TNF-α組NF-ΚB、IL-5、IL-8蛋白含量顯著高于對照組、TNF-α+PDTC組及TNF-α+TLR4抗體組(P均<0.01);TNF-α+PDTC組與TNF-α+TLR4抗體組之間差異無顯著性(P>0.05)。
  (4)TNF-α組TLR4mRNA表達水平顯著高于對照組及TNF-α+TLR4抗體組(P

14、均<0.01);TNF-α+TLR4抗體組TLR4表達水平與對照組之間無顯著性差異(P>0.05)。
  (5)TNF-α組TLR4蛋白表達水平顯著高于對照組及TNF-α+TLR4抗體組(P均<0.01);對照組 TLR4表達水平顯著高于 TNF-α+TLR4抗體組(P<0.01).
  3結果
  (1)哮喘4周組、哮喘8周組的氣道壁 EOS計數均較正常對照組顯著增加(P<0.01),且隨哮喘天數的增加 EOS計數也

15、有增加的趨勢,且兩組間比較差異有顯著性(P<0.05)。地塞米松治療4周組與哮喘4周組相比較低,有顯著差異(P<0.05),地塞米松治療8周組較哮喘4周組、哮喘8周組、地塞米松治療4周組相比較低,有顯著差異(P<0.01),但與正常對照組相比仍較高(P<0.01),治療8周組較治療4周組相比較低,有顯著差異(P<0.05)
  (2)哮喘4周組及哮喘8周組支氣管壁厚度(WA/pi)、支氣管壁平滑肌厚度(平滑肌的面積/pi)、支氣管

16、壁平滑肌細胞核數量(N/pi)均較正常對照組明顯增加(P<0.01),且隨哮喘天數的增加上述指標亦有增加趨勢,哮喘8周組較哮喘4周組明顯增加(P<0.01);治療4周組與哮喘4周組、治療8周組與哮喘8周組相比顯著降低(P<0.01),但治療組與正常組相比仍較高(P<0.01)。(3)哮喘4周組、哮喘8周組的氣道反應性均高于正常對照組(P<0.01)。治療4周組氣道反應性較哮喘4周組下降,有差異(P<0.05),哮喘8周組氣道反應性較哮喘

17、4周組明顯增高(P<0.01)。治療8周組氣道反應性較哮喘4周組、哮喘6周組、治療4周組均顯著降低(均為 P<0.01),但仍高于正常對照組(P<0.01)。
  (4)哮喘4周組、哮喘8周組的TLR4及NF-ΚB的mRNA水平明顯高于地塞米松治療4周組、地塞米松治療8周組及對照組(P<0.01);TLR4及NF-ΚB的mRNA水平隨哮喘天數的增加而明顯增加(P<0.01);地塞米松治療4周組的 TLR4及 NF-ΚB的 mRNA

18、水平明顯高于地塞米松治療8周組(P<0.05)。
  (5)哮喘4周組、哮喘8周組的TLR4蛋白質表達明顯高于地塞米松治療4周組、地塞米松治療8周組及對照組(P<0.01);哮喘8周組的TLR4蛋白質表達高于哮喘4周組(P<0.05), TLR4蛋白水平隨哮喘天數的增加而明顯增加;地塞米松治療8周組TLR4蛋白質表達高于對照組(P<0.05)。
  (6)哮喘4周組、哮喘8周組 PCNA的蛋白表達量均明顯高于正常對照組(P<

19、0.01),且哮喘兩組間上述指標差異有顯著性(P<0.05);地塞米松治療8周組PCNA的蛋白表達量明顯低于哮喘4周組、哮喘8周組及地塞米松治療4周。哮喘4周組、哮喘8周組及地塞米松治療4周組Bcl-2的蛋白表達量與對照組相比明顯增高(P<0.01);地塞米松治療4周Bcl-2的蛋白表達明顯高于地塞米松治療8周(P<0.05)。
  結論:
  1、siRNA-TLR4轉染哮喘大鼠ASMCs的最佳轉染時間是24小時。

20、  2、TLR4可能參與調控哮喘大鼠氣道平滑肌細胞的增殖、凋亡和IL-5、IL-8合成、分泌,從而參與氣道重構和氣道炎癥的發(fā)生、發(fā)展過程。
  3、TLR4可能通過 NF-ΚB傳遞生物信號調控哮喘大鼠氣道平滑肌細胞的增殖、凋亡和合成、分泌,在哮喘的氣道重構和氣道炎癥中起重要作用。
  4、TLR4可能通過 NF-ΚB參與哮喘大鼠模型的氣道平滑肌增殖凋亡的調控,地塞米松可能通過抑制TLR4表達,下調NF-ΚB活性抑制細胞增殖反

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