TAK1siRNA對RA患者滑膜細胞中mmp9和timp1表達的影響.pdf

1、前言：
　　 類風濕性關節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種慢性進行性自身免疫性疾病,以關節(jié)滑膜炎及對稱性關節(jié)骨、軟骨破壞為主要特征。RA的發(fā)病率在我國約為0.4%,其第一個5年致殘率達30%,平均縮短壽命5～7年,已經成為一種嚴重威脅人類健康的疾病。近年來發(fā)現RA滑膜細胞在類風濕關節(jié)炎發(fā)揮主要的作用,特別是分泌一些細胞因子像IL-1,TNF-α,聚蛋白多糖酶等誘導關節(jié)炎癥的發(fā)生和關節(jié)軟骨的破壞。而且這些

2、炎性因子之間相互作用,呈級聯(lián)放大作用,促成關節(jié)炎癥的不斷加重。所以尋求一種良好的治療方法成為現在學者研究的焦點。
　　 生長因子蛋白激活激酶(TAK1)屬于MAPKKK家族,能被多種細胞因子包括IL-1β,IL-18,TNF-α等激活。細胞因子與膜受體結合后,通過TAK1磷酸化并激活MAP2Ks家族的MEK3/6和MEK4/7,隨后MEK3/6和MEK4/7分別激活MAPK家族的P38激酶、應激活化激酶(JNK)進而激活轉錄因子

3、激活蛋白1(AP-1)。此外TAK1還能激活IKK,從而使NF-κB進入細胞核中,參與基因轉錄。轉錄因子AP-1和NF-κB能上調多種RA發(fā)病中的重要基因產物表答,如基質金屬蛋白酶(MMPs)、環(huán)氧化酶2(COX-2)和多種細胞因子。其中MMPs可導致關節(jié)破壞;COX-2增加前列腺素生成,導致疼痛和持續(xù)滑膜炎癥;細胞因子刺激周圍的滑膜細胞產生更多的炎性因子,形成正反饋機制使RA病情不斷持續(xù)和進展。目前已有研究表明在骨性關節(jié)炎軟骨細胞中T

4、AK1大規(guī)模的表達,并且阻遏TAK1基因可以使其下游炎性因子表達減少。我們所作的前期工作已經證實了TAK1在RA病人滑膜中有較高水平的表達和活性,因此推斷TAK1可能在RA發(fā)病中起重要作用,阻斷TAK1將有助于降低致炎性細胞因子對RA關節(jié)和滑膜的影響,TAK1可以作為RA基因治療中的一種新的靶基因。
　　 金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP)是MMP的特異性抑制劑,在ECM代謝調節(jié)中是與MMP對應的負調節(jié)劑。主要由氨基末端和羧基末端

5、結構域來維持自身的穩(wěn)定性,目前已明確的TIMP主要有四種即TIMP1、TIMP2、TIMP3、TIMP4。其中TIMP1能抑制絕大多數MMP可與MMP9前體及有活性的MMP1、3、9形成高度親和的、非共價鍵結合的復合物。TIMP在組織中的主要作用是調節(jié)蛋白水解和抗水解作用之間的平衡,進而維持細胞外基質的穩(wěn)定性。MMP與TIMP之間維持一種平衡的關系,一旦這種關系被打破就會導致細胞外基質分解和組織結構的重朔。TIMP1與TIMP家族中其他

6、的成員不同,并沒有明確的特異性。它既可以抑制大多數MMP酶類,也可以抑制人金屬肽酶含血小板反應蛋白(ADAMTS)像ADAMTS-4和ADAMTS-5。目前已有研究證實重組的人TIMP1可以明顯抑制ADAMTS-4和ADAMTS-5,這種抑制作用甚至強于對MMP的抑制。TIMP1可以在發(fā)育的胚胎細胞、正常的人軟骨和滑膜細胞中表達,在關節(jié)炎滑膜細胞中表達會上調。另外在體外培養(yǎng)的滑膜成纖維細胞和軟骨細胞中可被轉化生長因子上調。IL-1也可更

7、進一步放大TIMP1的分泌。
　　 基質金屬蛋白酶(MMP)是關節(jié)軟骨中降解聚蛋白多糖和膠原的主要酶類,MMPs是在聚蛋白多糖核心蛋白的球間區(qū)(IGD)Asn3412Phe342位點裂解聚蛋白多糖,產生的聚蛋白多糖片段分別為G12DIPEN和FFG。MMP家族在類風濕關節(jié)炎的軟骨、滑液、滑膜均有明顯的增高趨勢,它主要通過炎性通路被上游的介質激活。大量的研究證實MMP在RA的診斷中具有重要的意義。MMP與TIMP之間維持一種平衡的

8、關系,特別是TIMP1與MMP9特異結合,抑制后者的降解作用。同時又受轉化生長因子激活激酶的調節(jié),TAK1激活JNK誘發(fā)MMP1基因表達導致關節(jié)炎的發(fā)生。MMPs可降解細胞外基質的內肽酶,其可降解關節(jié)骨與軟骨中的膠原、蛋白多糖及其他的基質大分子,從而促進血管翳對軟骨的侵蝕。故而滑膜中的成纖維樣細胞來源的MMPs是導致關節(jié)病理損傷的重要因素。并有報道滑膜的過度生長引發(fā)致炎細胞因子及基質金屬蛋白酶的產生。正?；け桓布毎A患者滑膜A型細

9、胞基本上不能合成或很少合成MMPs,在RA過程中,增生的B型滑膜細胞可能在巨噬細胞分泌的IL-1、TNF-α等細胞因子刺激下,持續(xù)合成和分泌酶原形式的MMP-3。在血漿激肽釋放酶、纖溶酶或組織蛋白酶G等的作用下,轉化為具有活性的MMP-3,并激活滑膜被覆細胞分泌的膠原蛋白酶原,進而引發(fā)MMPs家族其他成員活化。Gravallese利用原位雜交測定MMPs的RNA,發(fā)現MMP-3在滑膜組織中過度表達,且滑液中含有大量MMP-3;另外,對R

10、A患者滑液中蛋白多糖、核心蛋白的分析表明,他們在原位被MMP-3所清除。1987年Okada研究發(fā)現,RA患者的關節(jié)液中MMP-1,MMP-2,MMP-3顯著增高,對關節(jié)結構有明顯破壞作用,早期RA血清中MMP-1,MMP-2的表達水平與疾病的活動性和預期的功能損害及X線表現呈正相關。通過對307例臨床患者研究發(fā)現,患者關節(jié)液中MMP-3濃度顯著增高可以作為RA的早期診斷和治療觀察指標之一,尤其在血清陰性患者中適合?；蜓芯堪l(fā)現,MMP

11、-3的基因多態(tài)性與RA的嚴重性相關,而不是與RA是否發(fā)生相關,研究這種多態(tài)性有助于早期預見RA的嚴重程度。雖然發(fā)現血清MMPs水平與疾病的活動相關,但在疾病開始的時候血清pro-MMP-3高水平表達預示疾病的進展可能比較嚴重。
　　 材料與方法：
　　 一、實驗材料
　　 1、11例滑膜組織標本來源于2009年11月-2010年12月中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院骨科住院患者。所有患者診斷均符合美國風濕病學會1987年

12、提出的診斷標準,術前均經倫理學認證。RA患者男4例,女7例,年齡50-64歲,平均(56.2歲)。
　　 2、免疫組化染色試劑盒
　　 3、Real-timePCR反轉錄試劑盒
　　 4、DharmaFECTsiRNA轉染試劑盒
　　 實驗方法
　　 1、細胞培養(yǎng)
　　 RA患者滑膜細胞在DMEM培養(yǎng)基和10%胎牛血清中于37℃、5%CO2條件下進行培養(yǎng)。細胞單層生長達80-85%培養(yǎng)面積

13、后,用于實驗或傳代。
　　 2、細胞鑒定
　　 將培養(yǎng)至三代的滑膜細胞做免疫組化鑒定,取出貼滿細胞的蓋玻片,10%甲醛溶液固定30min。晾干后PBS沖洗三次,加入3%H2O25-10min,PBS沖洗后,加入正常善養(yǎng)血清,室溫靜置10-15min,傾去、勿洗、甩干,加一抗過夜。滴加辣根過氧化物酶,室溫孵育10min,PBS沖洗3×3min,DAB顯色。顯色完全后復染、脫水、封片。
　　 3、細胞轉染
　　

14、 取對數生長期的滑膜細胞種植于六孔板中,種板濃度3*105/孔。從六孔板中移除培養(yǎng)基,隨機將培養(yǎng)的滑膜細胞分為陰性對照組,實驗組。嚴格按照試劑說明書規(guī)定,每孔加入2mL配制好的FECT(含特異性siRNA)轉染液,培養(yǎng)細胞37C°、5%CO2孵箱中24h,用于mRNA分析。
　　 4、實時熒光定量PCR檢測
　　 提取RNA前半小時加入IL-1β置于孵箱中反應。吸盡6孔板中的轉染液,加入1mLTrizol,室溫靜置5m

15、in。氯仿0.2mL/mLTrizol,1000轉離心15min,將水相移入新管。異丙醇沉淀RNA,清洗完畢后加入反應體系反轉。PCR反應總體積25μL,其中SYBRPremixEx.TaqTM2×12.5μL、上、下游引物各0.5μL,三蒸水9.5μL,模板2μL。
　　 5、統(tǒng)計學分析
　　 統(tǒng)計學處理采用SPSS16.0統(tǒng)計分析軟件,計量資料描述用方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 實驗結果：

16、
　　 TAK1siRNA對RA患者滑膜細胞中mmp9和timp1表達的影響。
　　 本研究發(fā)現運用轉染技術高效抑制TAK1在RA滑膜細胞中的表達,real-timePCR發(fā)現timp1和romp9的表達不同程度的降低。兩者之間的下調比例存在明顯的不匹配關系。有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　 結論：
　　 1、通過在RA患者滑膜細胞中轉染TAK1siRNA后可抑制MMP9的表達。
　　 2、通