三種多聚物Polyactive、Ethicon、PLGA的BMP-2沉積仿生鈣磷涂層骨誘導(dǎo)作用的研究.pdf

1、骨缺損修復(fù)是目前臨床最常見的，同時(shí)也是最棘手的問題之一，至今沒有找到理想而又可靠的治療方法。自體骨移植和異體骨移植都有諸多無法克服的缺點(diǎn)。為此，化學(xué)合成理想的多聚物來代替骨移植成為近年的研究熱點(diǎn)。 化學(xué)合成的多聚物已經(jīng)在臨床上廣泛的使用。然而多聚物較低的骨引導(dǎo)性和缺乏骨誘導(dǎo)性的弱點(diǎn)限制了它們?cè)谂R床上大面積骨缺損修復(fù)方面的應(yīng)用。 目前，提高骨引導(dǎo)性能主要是通過引入涂層來實(shí)現(xiàn)的。然而許多涂層制備方法都需要用到有機(jī)溶劑，而可能

2、殘留的有機(jī)溶劑會(huì)損害細(xì)胞的成骨潛能。直接將陶瓷顆粒預(yù)先加入多聚物內(nèi)部的方法會(huì)降低生物活性陶瓷與成骨細(xì)胞相互接觸的機(jī)會(huì)。現(xiàn)有的、仿生礦化方法需要多聚物表面具有活性基團(tuán)才能形成涂層。 表面吸收引入骨生長(zhǎng)因子如骨形成蛋白2(Bone morphogenetic protein-2，BMP-2)是目前賦予多聚物骨誘導(dǎo)性的主要方法。然而表面吸附的蛋白暴露于生理?xiàng)l件下會(huì)表現(xiàn)出快速的、短暫的釋放，而無法維持誘導(dǎo)成骨的微環(huán)境。提高骨生長(zhǎng)因子劑量

3、或增大載體的表面積等方法都存在相應(yīng)的不足。 本研究采用兩段式鈣磷礦化法來實(shí)現(xiàn)在模擬生理的環(huán)境下在多聚物表面制備涂層，用以提高多聚物的骨引導(dǎo)性，并將其作為載體實(shí)現(xiàn)骨形成蛋白的緩慢釋放，從而維持骨生成的微環(huán)境，實(shí)現(xiàn)持續(xù)地誘導(dǎo)骨組織再生。 第一部分Polyactive、Ethicon、PLGA的三維結(jié)構(gòu)、表面化學(xué)性狀對(duì)仿生鈣磷涂層理化性質(zhì)的影響 本實(shí)驗(yàn)旨在明確多聚物的三維結(jié)構(gòu)、表面化學(xué)性狀等因素對(duì)仿生鈣磷涂層的形態(tài)、特

4、征基團(tuán)、化學(xué)成分等理化性質(zhì)的影響。 材料與方法： 實(shí)驗(yàn)選取polyactive，ethicon，PLGA三種多聚物，以collagen作為對(duì)照載體材料。采用兩段式涂層制備方法：第一段，通過浸潤(rùn)在5倍模擬體液內(nèi)在多聚物表面制備種子層；第二段，通過浸潤(rùn)在超飽和鈣磷溶液中在種子層的基礎(chǔ)上制備蛋白攜帶層。通過掃描電子顯微鏡(scanning electron microscopy，SEM)檢測(cè)四種載體材料的大體形態(tài)、表面結(jié)構(gòu)以及

5、涂層的形態(tài)結(jié)構(gòu)。通過傅立葉紅外衍射分析(fourier-transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR)來分析四種載體及涂層的主要的化學(xué)基團(tuán)。通過與掃描電鏡相連的能量彌散X線(engergy dispersive x-ray analysis，EDAX)分析來測(cè)量涂層的鈣磷元素比值。通過X線衍射分析(X-ray dispersive analysis)來鑒定鈣磷涂層的化學(xué)成分。 結(jié)果： SEM結(jié)

6、果顯示四種載體材料(三種多聚物和 collagen)的三維結(jié)構(gòu)均不相同，Polyactive和collagen呈多孔狀，而Ethicon和PLGA呈纖維狀。但在這四種載體材料表面所制備的種子層(無定形空球狀)和蛋白攜帶層(晶體)的形態(tài)相同。FTIR結(jié)果顯示四種載體材料的表面化學(xué)基團(tuán)各不相同，特征峰的形態(tài)及位置各異。但在其表面所形成涂層的化學(xué)基團(tuán)的特征峰及位置相同。EDAX結(jié)果顯示涂層鈣磷比隨著超飽和鈣磷溶液體積的變化而變化。XRD結(jié)構(gòu)表

7、明：種子攜帶層的化學(xué)成分為無定形的磷酸鈣(amorphous calcium phosphate，ACP)，蛋白攜帶層的化學(xué)成分為低鈣的羥基磷灰石(calcium deficient hydroxyapatite，CDHA)。 結(jié)論： 1.兩段式仿生生物礦化的方法能夠在多聚物表面形成均-的鈣磷涂層。 2.在不同多聚物載體上制備的鈣磷涂層具有相同的形態(tài)和化學(xué)組成。 第二部分：蛋白與仿生鈣磷涂層在多聚物表面的

8、共沉積及其控制釋放 材料與方法： 在制備蛋白攜帶層過程中，加入牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA)作為蛋白樣品與涂層發(fā)生共沉積。所制備的樣品通過傅立葉紅外衍射分析(FTIR)分析蛋白的引入對(duì)于涂層化學(xué)組成的影響。采用標(biāo)記與牛血清白蛋白相連的異硫氰氨酸熒光素(Fluoresceine isothiocyanate，F(xiàn)ITC)的作為蛋白標(biāo)記物檢測(cè)與涂層共沉積的蛋白的體外釋放曲線。采用雙熒光標(biāo)記的方

9、法：用羅丹明標(biāo)記種子層，用FITC—BSA標(biāo)記蛋白攜帶層，通過激光共聚焦顯微鏡(Laser confocal scanning microscopy，LCSM)來檢測(cè)兩段式涂層微觀排列及共沉積蛋白在涂層內(nèi)的分布。 結(jié)果： 涂層與蛋白共沉積后，涂層本身的特征峰位置未發(fā)現(xiàn)明顯的位移。在蛋白酰胺Ⅰ帶所在的位置，涂層的特征峰與蛋白酰胺Ⅰ帶峰值發(fā)生重疊并向高位遷移，這種現(xiàn)象在四種載體材料上均有體現(xiàn)。與涂層共沉積的蛋白在可在體外持續(xù)

10、釋放35天以上。四種載體材料的蛋白釋放曲線的模式相同，均包括初期的快速釋放和后期的緩慢釋放?？焖籴尫诺乃俾逝c載體材料的三維結(jié)構(gòu)有關(guān)，纖維型多聚物的蛋白的釋放速率比多孔型多聚物低。后期緩慢釋放的速率與涂層溶解有關(guān)，在四種載體材料上所表現(xiàn)的速率相同。激光共聚焦顯微鏡下觀察顯示兩段式涂層沿著多聚物表面形成雙層結(jié)構(gòu)。蛋白在蛋白攜帶層內(nèi)均勻分布，而并非是通過吸收的方式進(jìn)入多聚物內(nèi)部。 結(jié)論：1.蛋白能夠與涂層共沉積在多聚體表面形成復(fù)合物。

11、 2.仿生涂層能夠?qū)崿F(xiàn)與其共沉積的蛋白持續(xù)地控制釋放，時(shí)間長(zhǎng)達(dá)5周以上。 3.四種不同載體表面與涂層共沉積蛋白的釋放曲線模式相同。 第三部分 Polyactive、Ethicon、PLGA的BMP-2沉積仿生鈣磷涂層在大鼠皮下異位成骨作用 材料與方法： 實(shí)驗(yàn)通過在無菌條件下與涂層共沉積的骨形成蛋白-2賦予多聚物骨誘導(dǎo)性。所攜帶的BMP-2的量通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme—linked imm

12、unosorbant assay，ELISA)進(jìn)行測(cè)量。設(shè)立載體+涂層、單純載體、載體+吸附BMP-2三個(gè)對(duì)照組。將制備的樣品植入大鼠皮下異位成骨模型中。5周取出，后經(jīng)過固定、脫水、二甲基丙烯酸酯(methyl methacrylate，MMA)包埋、硬組織切片，隨機(jī)系統(tǒng)采樣，三維立體形態(tài)學(xué)(stereology)分析等，檢測(cè)新生骨組織的體積、分布。制備有涂層的樣品也進(jìn)行包埋，切片，隨機(jī)系統(tǒng)采樣，三維立體形態(tài)學(xué)分析等方法，作為0時(shí)間點(diǎn)樣

13、品名，分析多聚物表面密度等指標(biāo)。 結(jié)果： 在載體+涂層+共沉積BMP-2組和載體+吸附BMP-2組內(nèi)有新骨形成，在單純載體組和載體+涂層組無新骨形成。對(duì)于每一種載體，在載體+涂層+共沉積BMP-2組的新生骨總量高于載體+吸附BMP-2組。載體+涂層+共沉積BMP-2組的BMP-2誘導(dǎo)骨生成效能高于或顯著高于載體+吸附BMP-2組。載體+涂層+共沉積BMP-2組的新骨密度與0時(shí)間點(diǎn)多聚物表面積密度成正比。 結(jié)論：

14、 1.在四種載體上，與涂層共沉積的BMP-2能夠保持其生物活性，在大鼠皮下異位成骨模型中誘導(dǎo)新骨形成。 2.涂層共沉積BMP-2的誘導(dǎo)成骨效能高于載體表面單純吸附的BMP-2，而且這種成骨效能具有非BMP-2劑量依賴性。 3.誘導(dǎo)成骨功能化多聚物在0時(shí)間點(diǎn)的表面積密度是其誘導(dǎo)成骨活動(dòng)的主要調(diào)節(jié)因素。 第四部分 BMP-2沉積仿生鈣磷涂層對(duì)Polyactive、Ethicon、PLGA生物降解性和生物相容性的

15、影響 材料與方法 大鼠皮下異位成骨模型中，采用三維立體形態(tài)學(xué)(stereology)的分析方法，通過分析外體巨細(xì)胞的體積來檢測(cè)BMP-2共沉積仿生鈣磷涂層對(duì)多聚物生物相容性的影響。通過分析殘留多聚物的實(shí)體體積來分析BMP-2共沉積仿生鈣磷涂層生物降解性的影響。觀察脂肪組織的分布及體積來分析與涂層共沉積的BMP-2誘導(dǎo)成骨過程中脂肪組織的生長(zhǎng)及分布狀況。分析軟組織囊下組織總體積等指標(biāo)來全面評(píng)價(jià)功能化多聚物的生物功能性。

16、 結(jié)果： Polyactive各組在大鼠皮下種植5周后殘留多聚物的體積與0時(shí)間點(diǎn)無明顯差異。Collagen、PLGA、Ethicon各組中，載體+涂層組的殘留多聚物體積最高，單純載體組和載體+吸附BMP-2組相似；與載體+涂層組相比，載體+涂層+共沉積BMP-2組的殘留多聚物體積降低或顯著降低。載體+涂層+共沉積BMP-2組的軟組織囊下總體積高于其它三個(gè)對(duì)照組。除了collagen兩個(gè)無殘留組，外體巨細(xì)胞體積密度在載體+涂

17、層組最高，在載體+涂層+共沉積BMP-2組最低。新生的脂肪組織伴隨著新生骨組織生長(zhǎng)，在載體+涂層+共沉積BMP-2有大量新骨生成的組，新生脂肪組織體積顯著高于無骨生成的單純多聚物組和多聚物+涂層組。 結(jié)論： 1.載體的生物降解是多種因素綜合作用的結(jié)果。多聚物本身的生物降解性是決定性因素，在此基礎(chǔ)之上，共沉積的BMP-2能夠促進(jìn)多聚物的生物降解，而涂層本身對(duì)多聚物起保護(hù)作用。 2.BMP-2共沉積仿生涂層誘導(dǎo)成骨功