蛋白質(zhì)芯片技術(shù)對(duì)大鼠角膜移植免疫排斥反應(yīng)相關(guān)蛋白質(zhì)群的分析.pdf_第1頁(yè)
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1、研究背景: 移植排斥是角膜移植術(shù)失敗的主要原因,尤其是植床上有大量新生血管的高危角膜移植患者,移植后排斥反應(yīng)發(fā)生早且嚴(yán)重,移植物常被破壞。在局部或全身應(yīng)用免疫抑制劑的情況下,角膜植片的存活率仍小于35%,這已成為目前亟待解決的問(wèn)題。該反應(yīng)是一多因素參與的復(fù)雜過(guò)程,影響因素具有廣泛性和交叉性. 蛋白質(zhì)組是一個(gè)基因組所能編碼的所有蛋白的組合。蛋白質(zhì)組學(xué)是對(duì)一個(gè)基因組、一種生物、一種細(xì)胞、組織所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)及其相互作用的研

2、究,提供的資料更真實(shí)地反映基因、組織、器官的實(shí)際功能狀態(tài)。 蛋白質(zhì)芯片-飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(SurfaceEnhancedLaserDesorption/Ionization-TimeofFlightMassSpectrometry,SELDI-TOF-MS)是蛋白芯片與表面加強(qiáng)激光解吸電離飛行質(zhì)譜的技術(shù)組合。優(yōu)越性主要表現(xiàn)在:可直接用未經(jīng)純化的樣品進(jìn)行分析;樣品需求量少;靈敏度高;高通量。 與角膜相關(guān)的蛋白質(zhì)組研究在國(guó)際

3、上處于起步階段。淚液中很多蛋白質(zhì)成分為外分泌蛋白,受眼局部因素及全身狀態(tài)的雙重影響。在一些眼病或者全身疾病的研究中,已發(fā)現(xiàn)淚液有特征性的蛋白質(zhì)成分變化.淚液中的低豐度蛋白有相當(dāng)部分具有重要的生理和病理意義。有研究表明:角膜移植術(shù)后,淚液中的IgG、sIgA、LF呈一規(guī)律變化曲線.當(dāng)捧斥反應(yīng)發(fā)生時(shí),IgG水平異常升高,LF水平呈下降趨勢(shì)。檢測(cè)淚液中的IG含量,有助于預(yù)防角膜移植排斥反應(yīng)的發(fā)生和監(jiān)測(cè)排斥反應(yīng)是否治愈。還有研究表明急性排斥期房

4、水白蛋白、H型細(xì)胞角蛋白和α-1抗胰蛋白酶成分明顯升高,提示排斥期房水蛋白成分變化至少有三種機(jī)制:房水-血屏障的破壞、酶性降解和局部合成的蛋白釋放入房水。但是,對(duì)于血清中蛋白質(zhì)組的改變及與血清與角膜移植排斥反應(yīng)的相關(guān)分析及研究尚未見(jiàn)報(bào)道。 研究目的: 1.在原有動(dòng)物模型基礎(chǔ)上,改進(jìn)大鼠角膜移植模型建立技術(shù)技巧,并以此為基礎(chǔ),從組織形態(tài)學(xué)方面驗(yàn)證并探討角膜移植術(shù)后免疫排斥反應(yīng)的發(fā)病機(jī)制; 2.利用SELDI蛋白芯片

5、技術(shù)檢測(cè)發(fā)生與未發(fā)生角膜移植排斥反應(yīng)的大鼠淚液、房水以及血清的標(biāo)志蛋白表達(dá);對(duì)照分析蛋白成分變化機(jī)制,建立診斷模型,并驗(yàn)證模型的特異性與敏感性;篩選角膜移植捧斥反應(yīng)相關(guān)蛋白并分析其與角膜免疫排斥反應(yīng)相關(guān)的可能機(jī)制。 研究方法: 1.建立大鼠同種異體穿透性角膜移植模型,Wistar大鼠20只為供體,SD大鼠40只為受體,行SD大鼠右眼同種異體穿透性角膜移植,術(shù)中,Ⅰ組從角膜旁中心取植片,縫線保留長(zhǎng)度約1mm,Ⅱ組取角膜中心

6、植片,縫線盡量剪短; 2.術(shù)后大鼠隨機(jī)分為2組,每組20只。分別為Ⅰ組排斥組(生理鹽水對(duì)照組),Ⅱ組非排斥組(CsA滴眼液、典比殊滴眼液點(diǎn)眼).術(shù)后第1天開(kāi)始起在裂隙燈顯微鏡下進(jìn)行臨床觀察,對(duì)角膜混濁、水腫、新生血管三項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)分.所得數(shù)據(jù)以means±SD表示,應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行處理。統(tǒng)計(jì)方法:獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(Independent-SampleTTest),P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義; 3.兩組均于術(shù)

7、后第7天隨機(jī)取2只大鼠角膜,HE染色及常規(guī)透射電鏡觀察; 4.同時(shí)采集其他大鼠血液、淚液、房水.取血后血液在冰上靜置1h.0℃離心5000r/min10min。分離血清,與淚液、房水一并凍存于-80℃以備后用。 5.將每組18例淚液、房水標(biāo)本及16例血清標(biāo)本(每組有2例血清標(biāo)本發(fā)生凍融,放棄)隨機(jī)分為2組。取其中一組用于蛋白質(zhì)決策樹(shù)模型的建立:應(yīng)用WCX2蛋白芯片捕獲蛋白,蛋白質(zhì)離子化后,用PBSIIC型蛋白質(zhì)芯片閱讀機(jī)

8、對(duì)不同組淚液、房水及血清蛋白進(jìn)行檢測(cè),獲得各樣本的蛋白指紋圖譜。采用CiphergcnBiosystems公司的CiphergenProteinChip3.0版本機(jī)帶分析軟件自動(dòng)采集數(shù)據(jù),采用BiomarkerWizard軟件對(duì)芯片檢測(cè)得到的蛋白質(zhì)以基于最小Gini指標(biāo)方法建立決策樹(shù)模型,然后以10折交叉驗(yàn)證法(10-foldCross-validationEstimates)進(jìn)行決策樹(shù)評(píng)估,找出區(qū)分兩組樣本能力最強(qiáng)的蛋白質(zhì)組合;

9、 6.用另外一組標(biāo)本盲法檢測(cè)該模型的敏感性及特異性; 7.在Swiss-Prot和TrEMBL蛋白質(zhì)庫(kù)中對(duì)標(biāo)志蛋白進(jìn)行初步篩選。 結(jié)果: 1.2組大鼠術(shù)后角膜轉(zhuǎn)歸情況都按預(yù)期發(fā)展,標(biāo)本采集過(guò)程對(duì)大鼠角膜及全身情況沒(méi)有影響; 2.根據(jù)大鼠同種異體穿透性角膜移植術(shù)后評(píng)分,確定在術(shù)后第7天時(shí)Ⅰ組排斥組大鼠已經(jīng)發(fā)生角膜移植排斥反應(yīng),而Ⅱ組未排斥組大鼠沒(méi)有發(fā)生角膜移植排斥反應(yīng); 3.HE染色發(fā)現(xiàn)角膜植片上

10、皮基底細(xì)胞形成很多空泡,間質(zhì)結(jié)構(gòu)疏松,大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),主要存在于上皮層和淺層基質(zhì)?;|(zhì)層可見(jiàn)新生血管官腔; 4.透射電鏡發(fā)現(xiàn)排斥反應(yīng)發(fā)生的角膜上皮層層次紊亂,表層細(xì)胞微絨毛消失,細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)不明顯,細(xì)胞間橋粒纖維化,含豐富糖原顆粒;固有層膠原微纖維平行排列規(guī)律性消失,細(xì)胞核濃縮,染色質(zhì)邊集,核膜不清,部分消失,周?chē)⒔Y(jié)構(gòu)不清,殘留內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張及豐富糖原堆積,固有層膠原角化,可見(jiàn)脂滴; 5.在分子量1000-20000D

11、a范圍內(nèi): 5.1淚液 5.1.1淚液排斥與非排斥組中共有108個(gè)蛋白質(zhì)被標(biāo)記,其中有分類(lèi)價(jià)值的標(biāo)志蛋白質(zhì)有11種,相對(duì)分類(lèi)價(jià)值較高的有6種,其中M2167.66、M3356.53在排斥反應(yīng)組中表達(dá)下調(diào),M1169.86、M1183.69、M9238.59、M11882.2在捧斥反應(yīng)組中表達(dá)上調(diào); 5.1.2盲法檢測(cè)結(jié)果,該決策樹(shù)模型敏感性為78%,特異性為89%; 5.1.3蛋白質(zhì)搜庫(kù)結(jié)果提示相關(guān)蛋白可

12、能是下調(diào)蛋白:Pro-histogranin、胰高血糖素樣肽1(GLP-1);上調(diào)蛋白:β-防御素2、細(xì)胞凋亡蛋白酶-3(Caspase-3)亞基、神經(jīng)激肽A(NKA); 5.2房水 5.2.1房水排斥與非排斥組中共有87個(gè)蛋白質(zhì)被標(biāo)記,其中相對(duì)分類(lèi)價(jià)值較高的蛋白質(zhì)有6種。分別為M1037.98,M1436.29,M1326.12,M1082.37,M1067.86,M11261.6并且在排斥反應(yīng)組中表達(dá)上調(diào);

13、5.2.2盲法檢測(cè)結(jié)果:該決策樹(shù)模型敏感性為67%,特異性為78%; 5.2.3蛋白質(zhì)搜庫(kù)結(jié)果提示相關(guān)蛋白可能是血管緊張素-1(AGT-I)、血管緊張素-2(AGT-II)、神經(jīng)肽、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β; 5.3血清 5.3.1血清排斥與非排斥組中共有58個(gè)蛋白質(zhì)被標(biāo)記,其中相對(duì)分類(lèi)價(jià)值較高的蛋白質(zhì)有6種,分別為M8809.89,M7010.01,M4420.15,M3507.18,M4151.08,M1706

14、.30并且在排斥反應(yīng)組中表達(dá)上調(diào); 5.3.2盲法檢測(cè)結(jié)果:該決策樹(shù)模型敏感性為75%,特異性為75%; 5.3.3蛋白質(zhì)搜庫(kù)結(jié)果提示相關(guān)蛋白可能是神經(jīng)肽Y,β-抵抗素、高血糖素Cortistatin(CST)。 結(jié)論: 1.通過(guò)對(duì)建立大鼠穿透性角膜移植動(dòng)物模型技術(shù)的改進(jìn)以及標(biāo)本采集方法的探討,整理出一套行之有效的建立模型以及標(biāo)本采集的操作規(guī)程;保留縫線和鉆取植片部位等方法可以影響角膜移植術(shù)后的轉(zhuǎn)歸;

15、 2.術(shù)后第7天是大鼠角膜術(shù)后發(fā)生移植排斥組與未發(fā)生排斥組的分界點(diǎn)。是術(shù)后取材的時(shí)間點(diǎn); 3.大鼠角膜移植術(shù)后臨床觀察表現(xiàn)評(píng)估與HE染色組織形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果相符; 4.透射電鏡結(jié)果表明已發(fā)生排斥反應(yīng)的角膜植片超微結(jié)構(gòu)特征表現(xiàn)為細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死共存。由此我們推斷,細(xì)胞凋亡的確參與了角膜移植急性排斥反應(yīng)的發(fā)生;. 5.應(yīng)用SELDI-TOF-MS技術(shù)獲得大鼠角膜移植后淚液、房水、血清標(biāo)志蛋白表達(dá)圖譜的實(shí)驗(yàn)方法穩(wěn)定

16、可行,檢測(cè)出的淚液、房水、血清中的生物標(biāo)記物可正確區(qū)分捧斥與非排斥組大鼠; 6.Pro-histogranin可能通過(guò)轉(zhuǎn)化為histogranin,β-防御素通過(guò)參與直接及間接的免疫激活作用,CST通過(guò)刺激單核細(xì)胞的分化和激活參與角膜移植術(shù)后免疫排斥反應(yīng); 7.我們的試驗(yàn)結(jié)果表明在淚液、房水、血清的標(biāo)志蛋白表達(dá)中均有神經(jīng)肽的上調(diào)表達(dá).這提示我們?cè)诮悄さ拿庖吲醭夥磻?yīng)的后續(xù)研究中考慮神經(jīng)遞質(zhì)是否通過(guò)刺激單核細(xì)胞的分化和激活參

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