大劑量地塞米松改善免疫性血小板減少癥患者CD5+B細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)功能的研究.pdf

1、背景:免疫性血小板減少癥(ITP)由自身免疫機制介導(dǎo)，是血液系統(tǒng)常見的出血性疾病。多數(shù)患者體內(nèi)可以檢測到抗血小板膜糖蛋白(GP)的自身抗體，導(dǎo)致血小板破壞加速和/或巨核細(xì)胞生成血小板功能障礙。B細(xì)胞由于其分泌抗體的特性，長期以來在ITP中一直被認(rèn)為是重要的致病性因素。但近年來的研究表明，B細(xì)胞中存在著部分亞群可以負(fù)向調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，稱為調(diào)節(jié)性B細(xì)胞(Bregs)，主要通過分泌IL-10發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)。CD5是Bregs的重要表面標(biāo)志之一

2、，CD5+B細(xì)胞可以產(chǎn)生大量IL-10，因此CD5+B細(xì)胞在ITP免疫失衡機制及疾病發(fā)生發(fā)展中的作用不容忽視。大劑量地塞米松(HD-DXM)作為ITP治療的一線方案之一，廣泛作用于多種免疫細(xì)胞，如糾正Th1/Th2失衡、抑制樹突狀細(xì)胞成熟、減少促炎性細(xì)胞因子合成等，但其如何影響B(tài)regs尤其是CD5+B細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)功能尚未闡明。
　　目的:首先通過研究ITP患者外周血CD5+B細(xì)胞產(chǎn)生及分泌IL-10能力、對效應(yīng)性T細(xì)胞的增殖、

3、凋亡及Th1/Th2平衡的調(diào)控作用等，闡明ITP患者CD5+B細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)功能缺陷;然后比較HD-DXM治療前后ITP患者CD5+B細(xì)胞上述功能的變化，揭示HD-DXM改善CD5+B細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)功能的作用，從而幫助我們認(rèn)識CD5+B細(xì)胞在ITP發(fā)病機制中的作用，并進一步從B細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)功能角度加深對HD-DXM作用機制的理解;最后在TLRs信號傳導(dǎo)通路中初步鑒定出可能導(dǎo)致ITP患者CD5+B細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)功能障礙的分子缺陷。
　　

4、方法:（一）采集符合納入標(biāo)準(zhǔn)的初發(fā)ITP患者接受HD-DXM治療前后及健康志愿者靜脈血各2mL，F(xiàn)icoll密度梯度離心法分離外周血單形核細(xì)胞(PBMCs); PE-CD5/FITC-CD19流式抗體標(biāo)記，流式細(xì)胞術(shù)檢測CD5+CD19+B細(xì)胞的數(shù)量;在佛波酯(PMA)、離子霉素及布雷菲爾德菌素A(BFA)刺激條件下體外培養(yǎng)24小時后收獲細(xì)胞，表面標(biāo)記PE-CD5/FITC-CD19，固定、破膜后標(biāo)記APC-IL-10，流式細(xì)胞術(shù)檢測各

5、細(xì)胞亞群胞內(nèi)IL-10平均熒光強度及IL-10+細(xì)胞比例;留取部分標(biāo)本以熒光實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)方法檢測IL-10 mRNA表達;酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測血漿和培養(yǎng)上清液IL-10濃度。
　　(二）采集符合納入標(biāo)準(zhǔn)的初發(fā)ITP患者接受HD-DXM治療前后及健康志愿者靜脈血各20mL，分離PBMCs，免疫磁珠方法分別純化出CD5+CD19+B細(xì)胞、CD5-CD19+B細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞，CFSE標(biāo)記CD4

6、+T細(xì)胞，接種于預(yù)包被CD3mAb和CD28 mAb的96孔培養(yǎng)板，以不同梯度比例與CD5+CD19+B細(xì)胞或CD5-CD19+B細(xì)胞共培養(yǎng)3～6天后，流式細(xì)胞術(shù)檢測CD4+T細(xì)胞增殖狀態(tài);細(xì)胞標(biāo)記PI/Annexin-Ⅴ以檢測其凋亡狀態(tài);細(xì)胞培養(yǎng)上清液以ELISA方法檢測IL-4及IFN-γ的濃度;RT-PCR法檢測T-bet和GATA-3 mRNA的表達。
　?。ㄈ┎杉醢l(fā)ITP患者及健康志愿者靜脈血各20mL，分離PBMC

7、s，免疫磁珠方法分別純化出CD5+CD19+B細(xì)胞，運用PCR Array的方法，分析ITP患者CD5+B細(xì)胞中TLRs及其下游信號傳導(dǎo)通路異常表達的分子。
　　結(jié)果:（一）ITP患者外周血CD5+B細(xì)胞占淋巴細(xì)胞的比例及絕對值計數(shù)均顯著高于正常人，而且胞內(nèi)IL-10染色表明ITP患者CD5+B細(xì)胞表達更高的IL-10平均熒光強度;RT-PCR結(jié)果提示ITP患者IL-10mRNA表達亦高于正常對照。但在體外培養(yǎng)上清液中，ITP患者

8、的IL-10濃度明顯低于正常對照。在經(jīng)過HD-DXM有效治療的患者，外周血CD5+B細(xì)胞數(shù)量恢復(fù)正常，其胞內(nèi)IL-10表達進一步加強，IL-10 mRNA仍維持在較高水平，而培養(yǎng)上清液中IL-10的濃度則與正常相當(dāng)。
　?。ǘ┊?dāng)CD5+B細(xì)胞與CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)時，正常對照來源的CD5+B細(xì)胞可以抑制CD4+T細(xì)胞的增殖，并呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)。同時，CD5+B可促進CD4+T細(xì)胞的凋亡。與此相反，CD5-B細(xì)胞并不能抑制CD4+

9、T細(xì)胞增殖，反而在體外培養(yǎng)72小時后，CD4+T細(xì)胞的增殖輕度增加，但這種差異尚不具有統(tǒng)計學(xué)意義。CD5-B細(xì)胞對CD4+T細(xì)胞的凋亡無明顯影響。在ITP患者中，CD5+B細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)功能明顯受損。CD5+B細(xì)胞與CD4+細(xì)胞的比例增加至3∶1時方才顯現(xiàn)出對CD4+T細(xì)胞增殖的抑制作用。ITP患者CD5+B細(xì)胞促進CD4+T細(xì)胞凋亡的能力亦存在缺陷。接受HD-DXM治療后，CD5+B細(xì)胞抑制CD4+T細(xì)胞增殖的能力增強，促進凋亡的能力

10、也可恢復(fù)至與正常相當(dāng)。
　　在健康對照中，在B∶T細(xì)胞的比例僅為1∶5時，CD5+B細(xì)胞即可明顯抑制CD4+T分泌IFN-γ。 ITP患者的CD5+B細(xì)胞抑制IFN-γ分泌的能力明顯受損:只有當(dāng)B/T比例升至1∶1時，IFN-γ的分泌才有所下降;而且，即使在B/T比例達到5∶1時，ITP患者的CD4+T細(xì)胞仍可保留大約30％的IFN-γ分泌。CD5+B細(xì)胞對IL-4的分泌無明顯影響。接受HD-DXM治療后，CD5+B細(xì)胞抑制IFN

11、-γ分泌的的能力得到部分恢復(fù)，但未能達到正常水平。
　　（三）共有20個TLRs信號通路相關(guān)分子在ITP和正常對照之間表達明顯相異。在ITP組中高表達的分子有12個，分別為CLEC4E、F0S、IL1B、IL6、IL8、IRAK1、JUN、PTGS2、SIGIRR、TICAM2、TLR2和TNF。低表達的為8個，分別為CSF2、CSF3、IFNB1、IRF3、TLR10、TLR3、TLR7和TLR9。
　　結(jié)論:ITP患者外