銅綠假單胞菌氨基糖苷類耐藥基因的研究.pdf

1、目的:
　　本文應(yīng)用高通量測序以及基因組生物信息分析，以臨床分離的不同年份的銅綠假單胞菌(PA)為研究對象，研究已經(jīng)報道過的所有氨基糖苷類耐藥基因在PA中的分布情況;并發(fā)掘PA中氨基糖苷類耐藥新基因型，克隆候選基因，通過藥敏試驗來驗證新基因型的功能。進一步對該基因進行生物信息學(xué)分析，為銅綠假單胞菌所攜帶的耐藥基因分布規(guī)律、傳播機制研究打下基礎(chǔ)。
　　方法:
　　本課題以溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床分離得到的239株P(guān)A

2、為樣本，提取其混合基因組，并送至北京中科院基因組研究所進行solexa測序。通過一系列生物信息學(xué)工具，將測序得到的短序列與收集到的151條已報道氨基糖苷類耐藥基因序列比對分析，研究這151條氨基糖苷類耐藥基因在PA中的分布情況及豐度差異。同時進一步發(fā)掘新的耐藥基因型，選取其中的aadA4基因型為代表，設(shè)計引物PCR定位該基因所在的菌株。PCR篩選出的陽性菌株中的aadA4基因，對其進行生物信息分析，研究該基因的同源性和分子進化。將aad

3、A4新基因型片段連接到T載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109，提取重組子質(zhì)粒進行雙酶切，再將片段連接到pET-15b載體，轉(zhuǎn)化到表達宿主菌大腸桿菌BL21，涂布于含Amp平板上進行培養(yǎng)，篩選陽性菌株pET∷aadA4/BL21。然后通過瓊脂倍比稀釋法測定pET∷aadA4/BL21對17種藥物的MIC值，來驗證銅綠假單胞菌中aadA4新基因型的功能。同時藥敏試驗也研究了選取的45株銅綠假單胞菌對17種藥物的MIC值，觀察該院分離的銅綠假單胞菌的

4、對抗生素的耐藥性情況以及分析aadA4基因陽性株與陰性株耐藥性的差異。
　　結(jié)果:
　　1.銅綠假單胞菌混合基因組高通量測序結(jié)果產(chǎn)生的短序列reads總數(shù)有70，239，195條，reads的長度均為100nt。將reads比對到151條氨基糖苷類耐藥基因序列上，最后發(fā)現(xiàn)有25個基因型存在于銅綠假單胞菌中。其中豐度最高的基因型為aph(3')-Ⅱb，豐度有1636.218X，覆蓋度99.88％;豐度最低的基因型是aadA41

5、2，豐度有2.2X，覆蓋度80.1％。
　　2.從239株銅綠假單胞菌中，PCR篩選出兩株菌TL1229、TL1285，包含有aadA4基因型，其余銅綠假單胞菌均不含aadA4基因型。
　　3.PCR產(chǎn)物測序結(jié)果分析，TL1229與TL1285中的aadA4基因型比對identity為100％，TL1229、TL1285中的aadA4基因型與參照序列aadA4比對identity為95％，且發(fā)生了氨基酸水平的差異。
　

6、　4.aadA4新基因型進行進化樹分析，發(fā)現(xiàn)與大腸桿菌中的YP_190214蛋白親緣關(guān)系最近，銅綠假單胞菌中aadA4基因的來源可能是由大腸桿菌水平轉(zhuǎn)移而來。
　　5.成功將aadA4基因連接到pET-15b表達載體，并成功構(gòu)建表達目的重組菌pET∷aadA4/BL21。
　　6.MIC功能驗證，TL1229、TL1285中發(fā)現(xiàn)的aadA4新基因型對鏈霉素、大觀霉素和新霉素的MIC值比對照組高出4個濃度梯度左右，對其他抗生素

7、則沒有明顯的作用。
　　7.醫(yī)院分離的銅綠假單胞菌對鏈霉素、大觀霉素、核糖霉素、頭孢唑啉鈉、氨芐西林鈉和替卡西林具有很強的耐藥作用，MIC值達到了1024μg/mL以上。TL1285、TL1185、TL1208、TL1288、TL1289這五株菌幾乎對所有的藥物MIC都很高，相比于其它銅綠假單胞菌，尤其對卡那霉素、妥布霉素、新霉素、慶大霉素、西索米星、小諾米星、阿米卡星、奈替米星的MIC值均達到了128μg/mL以上。
　　

8、結(jié)論:
　　1.高通量測序技術(shù)和生物信息工具的結(jié)合，能使我們在短時間內(nèi)測定上百株細菌的核酸序列，通過對病原菌序列進行大規(guī)模分析來探索基因組序列結(jié)構(gòu)與病原微生物的耐藥性的關(guān)系，對于致病菌中耐藥基因的分布及新基因的發(fā)掘和功能研究起著極為有效的作用，為新藥的研制開發(fā)提供了新的思路。
　　2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院分離的銅綠假單胞菌中含有豐富的氨基糖苷類耐藥基因，并且已經(jīng)產(chǎn)生多重耐藥菌株。
　　3.銅綠假單胞菌菌株TL122