白念珠菌Rps4p和Ste18p的功能研究.pdf

1、白念珠菌是重要的機(jī)會(huì)性致病真菌。它可以引起包括粘膜感染和危及生命的系統(tǒng)性疾病等多種疾病。最近幾年，隨著免疫抑制劑治療的增加，長(zhǎng)期的導(dǎo)尿技術(shù)的運(yùn)用，以及廣譜抗生素的使用，導(dǎo)致了念珠菌感染病例的逐年上升，其中白念珠菌占了很高的比例。白念珠菌作為具有多種形態(tài)的真菌，一種重要的形態(tài)轉(zhuǎn)換就是在各種菌絲誘導(dǎo)條件下從單一細(xì)胞的酵母態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槎嗉?xì)胞的菌絲態(tài)。白念珠菌的這種“酵母—菌絲”形態(tài)轉(zhuǎn)變?cè)诎啄钪榫荒さ男纬蛇^(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。白念珠菌的另一種

2、形態(tài)轉(zhuǎn)換是在純合子的狀態(tài)下，從白色形態(tài)到不透明態(tài)的轉(zhuǎn)換，這種轉(zhuǎn)換在白念珠菌的交配過(guò)程中起著重要的作用。
　　 核糖體是細(xì)胞合成蛋白質(zhì)的重要場(chǎng)所。成熟的核糖體由核糖體RNA(rRNA)和核糖體蛋白(RP)組成。核糖體蛋白是核糖體的重要組成部分，其主要功能是保證蛋白質(zhì)合成的順利進(jìn)行。在真核生物中，缺失胞漿核糖體蛋白將會(huì)導(dǎo)致生長(zhǎng)率的降低和其他生理表型的缺陷。最近的研究發(fā)現(xiàn)，核糖體蛋白不僅具有組成核糖體蛋白的功能，還可能參加了其他的生命

3、活動(dòng)，即具有核糖體外功能。最近的研究表明，真核生物的核糖體蛋白S4（Rps4p）具有潛在的核糖體外功能。在釀酒酵母中，Rps4p與細(xì)胞大小，端粒長(zhǎng)度，過(guò)氧化氫敏感度和硫酸新霉素的敏感度有關(guān)。小麥的Rps4p具有半胱氨酸酶活性。而研究也表明，人類的唐氏綜合征也可能與Rps4p相關(guān)。這些研究結(jié)果提示了真核生物的Rps4p具有潛在的核糖體外功能。
　　 本課題主要關(guān)注了白念珠菌核糖體蛋白S4的功能。在釀酒酵母中，Rps4p由同源基因R

4、PS4A和RPS4B編碼。雖然兩個(gè)基因編碼的蛋白質(zhì)的序列的一致程度相當(dāng)高，但兩個(gè)基因卻表現(xiàn)出了不同的表型。這些現(xiàn)象為我們研究白念珠菌的Rps4p的功能提供了很好的線索。在白念珠菌中，Rps4p由同源基因RPS41和RPS42編碼，長(zhǎng)度為262個(gè)氨基酸?；騌PS41位于白念珠菌染色體的2號(hào)染色體上，全長(zhǎng)為789bp，不含有內(nèi)含子;基因RPS42位于白念珠菌染色體的1號(hào)染色體上，全長(zhǎng)為1358bp，含有一個(gè)長(zhǎng)度為569bp的內(nèi)含子?；騌

5、PS41和RPS42所編碼的蛋白僅有一個(gè)氨基酸的差異。
　　 為了深入研究Rps4p的功能，我們用“Ura-Blaster”基因敲除策略在CAI4菌中分別構(gòu)建了rps41⊿和rps42⊿基因缺失菌和相應(yīng)的回復(fù)菌?！癠ra-blaster”基因敲除策略雖然需要構(gòu)建重組質(zhì)粒，具有一定的工作量;營(yíng)養(yǎng)選擇標(biāo)記URA3對(duì)表型也有一定的影響等缺點(diǎn)。但本方法也具有其無(wú)可取代的優(yōu)點(diǎn)。首先，該方法成熟穩(wěn)定，應(yīng)用范圍廣，在技術(shù)操作上易于實(shí)現(xiàn)。其次，

6、可以在基因敲除片段兩端構(gòu)建較長(zhǎng)的目的基因同源序列，增加同源重組過(guò)程的特異性，較易獲得基因敲除菌株，特別是對(duì)較難敲除的基因尤為有效。再次，URA3營(yíng)養(yǎng)選擇標(biāo)記可以重復(fù)利用，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)多拷貝基因的敲除或者同一菌株的多基因敲除，其他基因敲除方法很難實(shí)現(xiàn)。本課題中的RPS41和RPS42均具有三拷貝，所以“Ura-blaster”基因敲除策略比較適合本課題。雖然有文獻(xiàn)報(bào)道，URA3基因的表達(dá)量和在染色體的位置對(duì)白念珠菌的毒力等表型有所影響，但這

7、些缺點(diǎn)是可以克服的。有文獻(xiàn)報(bào)道，將URA3插在RP10，ENO1，ARG4等基因位置或者URA3在染色體中的原始位置，這樣可在一定程度上消除URA3的影響。本課題統(tǒng)一將URA3營(yíng)養(yǎng)選擇標(biāo)記回復(fù)在RP10的位置，來(lái)消除URA3的影響。
　　 我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，RPS41基因的缺失將導(dǎo)致白念珠菌很多方面的功能缺陷。通過(guò)生長(zhǎng)率測(cè)定實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)rps41⊿基因缺失菌表現(xiàn)為生長(zhǎng)速率顯著降低，而rps42⊿基因缺失菌的生長(zhǎng)速率與野生菌沒(méi)有明

8、顯的差別。通過(guò)測(cè)定，rps41⊿基因缺失菌的平均生長(zhǎng)率為μ=0.48 h-1，rps42⊿基因缺失菌的生長(zhǎng)率為μ=0.68 h-1，而野生菌CAI4的生長(zhǎng)率為μ=0.66 h-1。rps41⊿基因缺失菌的生長(zhǎng)速率相對(duì)于rps42⊿基因缺失菌和野生菌降低了28％左右。
　　 為了檢測(cè)rps41⊿基因缺失菌的被膜形成能力，我們利用掃描電鏡來(lái)檢測(cè)成熟生物被膜的結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，rps41⊿基因缺失菌的被膜形成較野生菌大量降低。野生菌的生

9、物被膜呈經(jīng)典的三維結(jié)構(gòu)，主要由菌絲構(gòu)成。而rps41⊿基因缺失菌的生物被膜的形成受到了抑制，以酵母態(tài)和假菌絲態(tài)為主，很少看見(jiàn)真菌絲。為了尋求RPS41基因影響生物被膜形成的機(jī)制，我們從影響生物被膜形成的各個(gè)方面進(jìn)行了研究。我們首先考察了影響被膜形成的關(guān)鍵因素，菌絲形成能力。利用菌絲形成實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)rps41⊿基因缺失菌的菌絲形成能力下降，而rps42⊿基因缺失菌的菌絲形成沒(méi)有受到明顯的影響。其次，我們考察了影響生物被膜形成的另一重要因

10、素，抗氧化能力。我們發(fā)現(xiàn)rps41⊿基因缺失菌的對(duì)過(guò)氧化氫的敏感度是升高的，說(shuō)明了其抗氧化能力的下降。而rps42⊿基因缺失菌與野生菌相比沒(méi)有顯著的變化。再次，我們利用二維電泳技術(shù)分析了野生型菌和rps41⊿基因缺失菌生物被膜狀態(tài)下的蛋白質(zhì)組。蛋白質(zhì)組分析結(jié)果表明，rps41⊿基因缺失菌的能量代謝主要以無(wú)氧呼吸為主，抗氧化的相關(guān)蛋白表達(dá)水平上升，表明了其體內(nèi)的ROS水平較野生菌低，從而表明了其菌絲形成能力是降低的。同時(shí)我們也發(fā)現(xiàn)菌絲形成

11、相關(guān)蛋白也是低表達(dá)的。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，白念珠菌生物被膜的形成時(shí)依賴于Rps4p的。我們還進(jìn)行了體內(nèi)毒力實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)兩個(gè)基因缺失菌的毒力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，rps41⊿基因缺失菌的毒力是顯著降低的。野生菌和rps42⊿基因缺失菌感染組的小鼠平均生長(zhǎng)時(shí)間只有4-7天，而rps41⊿基因缺失菌感染組的小鼠平均生長(zhǎng)時(shí)間卻達(dá)到16天左右。我們還考察了RPS41和RPS42兩個(gè)基因的表達(dá)水平。結(jié)果表明，基因RPS42的缺失對(duì)基因RPS41的表達(dá)水平影響并不

12、是很明顯，而基因RPS41的缺失會(huì)強(qiáng)烈的誘導(dǎo)基因RPS42的表達(dá)，達(dá)到正常水平的20多倍。雖然基因RPS42被強(qiáng)烈的誘導(dǎo)，其所表達(dá)的Rps4p的mRNA也只有正常水平的20％.這些結(jié)果說(shuō)明，在正常情況下，主要由基因RPS41表達(dá)Rps4p，基因RPS42基本上處于沉默狀態(tài)?；騌PS41和RPS42的表達(dá)水平是不對(duì)稱的，基因RPS41在白念珠菌的生命活動(dòng)中比基因RPS42發(fā)揮更加關(guān)鍵的作用。RPS41基因的缺失并不是對(duì)所有的表型都有影響

13、，rps41⊿基因缺失菌對(duì)粘附生長(zhǎng)能力的影響不是很顯著，對(duì)唑類藥物敏感度也沒(méi)有明顯的變化。Rps4p的量的降低會(huì)影響核糖體的形成，可能會(huì)使某些蛋白質(zhì)的合成受到影響，但是這種影響是特異的，這表明了Rps4p功能的特異性，也揭示了Rps4p潛在的核糖體外功能。
　　 最近的研究表明白念珠菌具有交配的能力。參與交配的信號(hào)通路和釀酒酵母的是相似的。在白念珠菌中，缺失G蛋白的α亞基和β亞基將會(huì)導(dǎo)致白念珠菌完全喪失交配能力。但是G蛋白γ亞基

14、在白念珠菌交配過(guò)程中的作用還不是很清楚。為了明確G蛋白γ亞基在白念珠菌交配過(guò)程中的作用，本課題對(duì)STE18基因的功能進(jìn)行了研究。在白念珠菌中，基因STE18編碼經(jīng)典的G蛋白的γ亞基，氨基酸長(zhǎng)度為90個(gè)氨基酸。G蛋白γ亞基的氨基酸序列在裂殖酵母中有很高的保守性，并且C末端含有CAAX盒。我們利用同源重組的原理，構(gòu)建了ste18⊿基因缺失菌和STE18基因C末端敲除菌。結(jié)果表明，G蛋白的γ亞基和γ亞基的C末端在白念珠菌的交配中都是必需的。我