應(yīng)用GSTpull-down篩查HSF4b相互作用蛋白.pdf

1、白內(nèi)障是最重要的人類(lèi)眼科疾病，是人類(lèi)失明的最主要原因。熱休克蛋白4（HSF4）屬于熱休克轉(zhuǎn)錄因子(HSFs)家族，該家族成員可在熱或其它應(yīng)激情況時(shí)，激活熱休克反應(yīng)基因，調(diào)控細(xì)胞正常的生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程。HSF4基因是一個(gè)白內(nèi)障致病基因，其突變可引起先天性白內(nèi)障和年齡相關(guān)性白內(nèi)障。HSF4有兩種可變剪接本，編碼不同的亞型HSF4a和HSF4b，這兩種剪接轉(zhuǎn)錄本可能具有不同的功能，其中HSF4b在晶狀體中高度表達(dá)，被認(rèn)為與白內(nèi)障發(fā)生高度相關(guān)。盡

2、管幾個(gè)不同的研究小組制備了knock-out小鼠，但目前對(duì)HSF4突變引起白內(nèi)障的分子機(jī)制仍不清楚。
　　 發(fā)現(xiàn)HSF4基因的相互作用蛋白，對(duì)于揭示HSF4突變導(dǎo)致白內(nèi)障形成的分子機(jī)理具有重要意義。我們實(shí)驗(yàn)室克隆了HSF4的cDNA全長(zhǎng)序列，并構(gòu)建了晶狀體細(xì)胞cDNA文庫(kù)。應(yīng)用酵母雙雜交篩選，我們得到一些與HSF4b可能存在相互作用的蛋白，其中包括鋅指轉(zhuǎn)錄因子143（ZNF143），藍(lán)白斑實(shí)驗(yàn)表明這兩個(gè)基因存在相互作用。

3、　　 本研究中，我們首先選用GST pull-down試驗(yàn)，來(lái)驗(yàn)證是否HSF4b與ZNF143存在相互作用。我們構(gòu)建了能表達(dá)GST-HSF4b融合蛋白的原核表達(dá)載體質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)化BL21 菌株中進(jìn)行表達(dá)，通過(guò)谷胱甘肽瓊脂糖珠與GST的高免疫親和性進(jìn)行GST-HSF4b融合蛋白的純化，并通過(guò)GST pull-down分析來(lái)驗(yàn)證HSF4b與ZNF143的相互作用，在本研究中并未檢測(cè)到HSF4b與ZNF143蛋白之間的相互作用。
　　

4、 本研究中，我們還嘗試直接通過(guò)GST pull-down結(jié)合SDS-PAGE銀染色分析的方法，來(lái)尋找可能與HSF4b存在相互作用的未知蛋白，對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞裂解液中拉下的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳及通過(guò)銀染色，我們得到了兩條候選蛋白條帶。
　　 我們應(yīng)用GST pull-down方法，對(duì)酵母雙雜交得到的HSF4b相互作用蛋白進(jìn)行了驗(yàn)證，并應(yīng)用該法來(lái)直接尋找與HSF4b相互作用的未知蛋白。我們的研究為HSF4b的功能研究提供了