蘇云金芽胞桿菌Cry51Aa1與PS4蛋白結(jié)構(gòu)的比較與抗癌譜篩選.pdf

1、目的:①比較蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）Cry51Aa1蛋白與具有毒殺癌細(xì)胞活性的Parasporin蛋白之間的進(jìn)化關(guān)系及結(jié)構(gòu)異同，由結(jié)構(gòu)相似性推測(cè)目的蛋白Cry51Aa1蛋白可能具有的抗癌活性;②測(cè)試Cry51Aa1蛋白的抗癌活性及抗癌譜，篩選出1-2種敏感細(xì)胞株，并初步探討Cry51Aa1對(duì)靶癌細(xì)胞發(fā)揮毒性作用的機(jī)制，為研究Cry51Aa1的功能提供新的生物學(xué)證據(jù)。
　　方法:①采用生物

2、信息學(xué)在線數(shù)據(jù)庫(kù)分析Cry51Aa1的理化性質(zhì)并調(diào)取其氨基酸序列信息，同時(shí)調(diào)取已報(bào)道的6類19種抗癌Parasporin蛋白序列，應(yīng)用最大似然聚類法建立Cry51Aa1與PS家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹圖，找出可能與Cry51Aa1同源的PS蛋白;針對(duì)與Cry51Aa1序列相似度最高的PS蛋白，進(jìn)一步比較兩者在一級(jí)和二級(jí)結(jié)構(gòu)中的各項(xiàng)參數(shù)，并以SWISS-MODEL進(jìn)行同源建模，比較兩者的三級(jí)空間結(jié)構(gòu)，全面分析兩者結(jié)構(gòu)的異同。②純化Cry51Aa1蛋

3、白后，以18種細(xì)胞（包括12種人類腫瘤細(xì)胞，2種人類正常細(xì)胞，1種鼠腫瘤細(xì)胞，3種鼠正常細(xì)胞）作為受試對(duì)象，利用MTT實(shí)驗(yàn)初步篩選Cry51Aa1對(duì)各類細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用，對(duì)敏感細(xì)胞株進(jìn)一步分析時(shí)間和濃度因素對(duì)細(xì)胞生存率/抑制率的影響;③以流式細(xì)胞術(shù)(FCM)和免疫印跡實(shí)驗(yàn)(WB)探討Cry51Aa1是否通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方式發(fā)揮細(xì)胞毒性作用。
　　結(jié)果:①通過(guò)氨基酸序列聚類建立的系統(tǒng)進(jìn)化樹圖中，Cry51Aa1與PS4的氨基酸序

4、列相似度最高，達(dá)到36％，自引導(dǎo)評(píng)估得boostrap值（自展值）＞70，認(rèn)為可信度較好。從結(jié)構(gòu)比較中進(jìn)一步體現(xiàn)了兩者的結(jié)構(gòu)相似性，兩種蛋白模型在α-碳原子(Carboon alpha，CA)部分的結(jié)構(gòu)差異均方根(RMS)=0.92。②Cry51Aa1易引起敏感靶細(xì)胞發(fā)生腫脹等形態(tài)學(xué)改變，細(xì)胞形態(tài)改變的程度與濃度梯度呈現(xiàn)一致性變化，隨著作用時(shí)間的增加，腫脹的比例減少;③不同的細(xì)胞對(duì)Cry51Aa1的敏感性存在差異，腫瘤細(xì)胞敏感性高于正常

5、細(xì)胞，且不同腫瘤系統(tǒng)的細(xì)胞對(duì)Cry51Aa1的敏感性存在差異，篩選到的Cry51Aa1抗癌譜包括消化系統(tǒng)的SGC-7901、GBC-SD與RBE，生殖系統(tǒng)的Hela、HEC、HBL-100、MDA-MB-231;④較高濃度的Cry51Aa1引起細(xì)胞發(fā)生凋亡，且初步認(rèn)為，Caspase家族在Cry51Aa1引起的細(xì)胞凋亡中可能發(fā)揮了重要作用。
　　結(jié)論:①Cry51Aa1蛋白可能與抗癌PS蛋白同源，且與PS4在氨基酸序列上親緣關(guān)系最

6、近，兩者的結(jié)構(gòu)相似性較高;②Cry51Aa1蛋白對(duì)多種人類腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒性，且敏感性存在差異。本次篩選到的抗癌譜包括消化系統(tǒng)3個(gè)細(xì)胞株和生殖系統(tǒng)4個(gè)細(xì)胞株，胃癌SGC-7901表現(xiàn)最為明顯和穩(wěn)定，但Cry51Aa1的特異性毒性還需經(jīng)更大范圍的抗癌譜驗(yàn)證;③Cry51Aa1引起細(xì)胞發(fā)生形態(tài)學(xué)和細(xì)胞活力的改變，且即細(xì)胞抑制率與蛋白濃度成存在劑量-反應(yīng)關(guān)系，正比;④Cry51Aa1發(fā)揮細(xì)胞毒性可能是Caspase介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，且對(duì)細(xì)胞的