抗人CD45亞類新單抗ZCH-6-3A4識別抗原表位的研究.pdf

1、目的:
　　 急性白血病是兒童時期發(fā)病率最高的惡性腫瘤,我國每年至少有15000個新發(fā)病例。其中急性淋巴細(xì)胞性白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)約占70％,急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)約占25％。在兒童和青年的惡性腫瘤中白血病死亡率居首位。近年來聯(lián)合化療明顯改善了兒童ALL的預(yù)后,但仍有20％～30％的高危患兒缺乏有效干預(yù)手段,而AML治療效果更遜

2、色于ALL。治療失敗的原因,主要是常規(guī)化療選擇性差,毒副作用大,還有白血病細(xì)胞的化療耐藥及復(fù)發(fā)等問題。因此,有必要尋找選擇性高,毒副作用小的治療方法來進(jìn)一步提高白血病患兒生存率和生存質(zhì)量,而靶向治療可能是解決這一問題的重要途徑和目前的研究熱點(diǎn)。Rituximab(人鼠嵌合型抗人CD20單抗,美羅華)是靶向治療成功的典范,實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用證明該單抗在CD20+B細(xì)胞惡性淋巴瘤治療中具有良好療效。
　　 CD45是位于細(xì)胞表面的白

3、細(xì)胞共同抗原(leukocyte common antigen,LCA),穩(wěn)定并高水平地表達(dá)在除紅系細(xì)胞、巨核細(xì)胞系／血小板、正常的原始造血干細(xì)胞之外的所有造血細(xì)胞表面,并且在85％～90％的白血病細(xì)胞表面也表達(dá),而在機(jī)體其它非造血器官組織細(xì)胞不表達(dá),這種差異表達(dá)使其具有了良好的靶向性。抗CD45單抗的研制為白血病的靶向治療提供了新的手段。
　　 CD45編碼基因外顯子4、5、6或稱A、B、C的可選擇性剪接產(chǎn)生了多種變異體,在人

4、體細(xì)胞上,CD45RO、CD45RB、CD45RAB、CD45RBC、CD45RABC這5種變異體已在蛋白水平被檢測到,相對分子質(zhì)量范圍在180～220 kDa,CD45RAB和CD45RABC統(tǒng)稱為CD45RA。
　　 本實(shí)驗(yàn)室自行研制的具有自主知識產(chǎn)權(quán)的雜交瘤細(xì)胞系分泌的鼠抗人單克隆抗體ZCH-6-3A4(簡稱3A4)已經(jīng)通過國際鑒定為抗人CD45亞類抗體,屬鼠IgG1κ,2000年被第7屆國際人類白細(xì)胞分化抗原協(xié)作組會議(

5、簡稱HLDA7)正式命名為CD45RA。本實(shí)驗(yàn)室研究表明,3A4單抗不能阻滯CD45抗體(克隆名2D1,IgG1,識別180～220 kDa所有人CD45蛋白亞型)與KG1a細(xì)胞的反應(yīng),這表明3A4單抗與CD45抗體識別的表位不同。3A4單抗也不能阻滯CD45RO抗體(克隆名UCHL-1,識別180kDa的人CD45蛋白亞型CD45RO)與CD45RO陽性的T細(xì)胞反應(yīng),這表明3A4單抗不能識別CD45RO。3A4單抗能夠阻滯CD45RA

6、單抗(克隆名L48,識別220kDa的人CD45蛋白亞型CD45RABC)與KG1a細(xì)胞的反應(yīng)。一般來說,3A4既然能夠阻滯另一個標(biāo)準(zhǔn)CD45RA抗體與KG1a細(xì)胞的反應(yīng),那么它應(yīng)該識別與之相同的抗原表位,并且應(yīng)該具有類似的細(xì)胞反應(yīng)譜。但我們進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)3A4單抗與白血病細(xì)胞的反應(yīng)譜與CD45RA(L48)尚存在比較明顯的差別。因此,有必要澄清3A4單抗所識別抗原表位,為此單抗的進(jìn)一步深入研究及其應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:<

7、br>　　 (1)制備3A4 FITC直標(biāo)抗體。
　　 將3A4雜交瘤細(xì)胞系注入Balb／c小鼠腹腔內(nèi)制備含3A4抗體的腹水,采用SPA Sepharose親和層析法從腹水中純化3A4抗體蛋白。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)鑒定抗體純度及分子量,采用改良Marshall法制備異硫氰酸熒光素標(biāo)記的3A4抗體(3A4 FITC),并通過流式細(xì)胞術(shù)(flwo cytometry,FCM)鑒定。
　　 (2)建立

8、3A4識別的抗原表達(dá)譜。
　　 由于CD45編碼序列的外顯子4、5、6的可選擇性剪接而產(chǎn)生各種蛋白亞型,因此設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增CD45序列的外顯子2至外顯子8的部分序列(我們命名為CD45-1),PCR檢測各種細(xì)胞在基因水平的CD45亞型分布情況。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測3A4識別的抗原在人正常外周血、PHA活化的外周血T淋巴細(xì)胞、白血病細(xì)胞以及細(xì)胞系上的分布。并通過Western Blot檢測白血病細(xì)胞系上3A4抗原的分布。
　　

9、 (3)真核表達(dá)載體pcDNA3.1+／CD45RBC的構(gòu)建。
　　 根據(jù)美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)上檢索到的CD45基因序列(NM002838)設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增自起始密碼子至終止密碼子的CD45基因序列全長。由于外顯子4、5、6的可選擇性剪接導(dǎo)致有多個變異體同時存在,導(dǎo)致無法用單次PCR得到單個變異體,故把CD45基因人為的分割成4個部分(我們命名為CD45-1、CD45-2、CD45-3和CD45-4),CD45-1與

10、CD45-2、CD45-2與CD45-3、CD45-3與CD45-4均有一小段重疊序列。設(shè)計(jì)4對引物分別擴(kuò)增CD45-1(2-8號外顯子)、CD45-2(8-15號外顯子,1038bp)、CD45-3(15-24號外顯子,963bp)和CD45-4(24-33號外顯子,1343bp),其中CD45-1序列上游引物5’端引入Hindm酶切位點(diǎn),CD45-4序列下游引物5’端引入XhoⅠ酶切位點(diǎn)。然后采用重疊延伸拚接PCR(splicing

11、 by ovedap extension PCR,SOE-PCR)將CD45-1、CD45-2、CD45-3和CD45-4這4個片段在基因水平上拚接擴(kuò)增,克隆得到CD45基因全長的cDNA。并通過TA克隆系統(tǒng)將其克隆到pCR(R)-2.1載體中,經(jīng)測序鑒定,我們首先成功克隆得到的是序列完全匹配的pCR(R)-2.1／CD45RBC的TA克隆。因此我們首先構(gòu)建CD45RBC的真核表達(dá)載體。將pCR(R)-2.1／CD45RBC和真核表達(dá)載

12、體pcDNA3.1+用HindⅢ和XhoⅠ雙酶切后連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α,挑取克隆搖菌擴(kuò)增后抽提質(zhì)粒DNA經(jīng)酶切及測序鑒定為目的基因,至此得到真核表達(dá)載體pcDNA3.1+／CD45RBC。
　　 (4)真核表達(dá)載體pcDNA3.1+／CD45RA、pcDNA3.1+／CD45RAB和pcDNA3.1+／CD45RABC的構(gòu)建。
　　 CD45-1片段包括外顯子2至外顯子8的部分序列(外顯子4、5、6為可選

13、擇性剪接序列),因此而產(chǎn)生的變異體我們分別命名為CD45RO-1、CD45RA-1、CD45RB-1、CD45RC-1、CD45RBC-1、CD45RAB-1和CD45RABC-1,分別構(gòu)建相應(yīng)的TA克隆。各亞型均有一段99bp的共同序列(包括7號外顯子和8號外顯子部分堿基),其中有AfeⅠ的酶切位點(diǎn).將TA克隆pCR(R)-2.1／CD45RA-1、pCR(R)-2.1／CD45RAB-1、pCR(R)-2.1／CD45RABC-1和

14、pcDNA3.1+／CD45RBC分別用HindⅢ和AfeⅠ雙酶切后連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α,挑取克隆搖菌擴(kuò)增后抽提質(zhì)粒DNA經(jīng)酶切及測序鑒定為目的基因,至此分別得到真核表達(dá)載體pcDNA3.1+／CD45RA、pcDNA3.1+／CD45RAB和pcDNA3.1+／CD45RABC。
　　 (5)CD45抗原亞型在真核細(xì)胞膜上的表達(dá)及3A4抗體識別抗原的鑒定。
　　 將空載體pcDNA3.1+以及構(gòu)建成功的

15、真核表達(dá)載體pcDNA3.1+／CD45RA、pcDNA3.1+／CD45RBC、pcDNA3.1+／CD45RAB和pcDNA3.1+／CD45RABC分別搖菌擴(kuò)增,轉(zhuǎn)染級抽提試劑盒抽提質(zhì)粒,紫外分光光度計(jì)和電泳測質(zhì)粒DNA濃度和純度。然后采用LipofectamineTM2000試劑盒通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將空載體pcDNA3.1+和上述4個CD45基因亞型真核表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)染入真核細(xì)胞CHO,通過G418篩選并通過多次亞克隆建立穩(wěn)定

16、轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。抽提轉(zhuǎn)染后細(xì)胞總RNA,通過RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)基因的表達(dá)情況。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞膜上的CD45蛋白表達(dá)情況。通過流式細(xì)胞術(shù)及Western blot等方法鑒定3A4抗體所識別的抗原亞型。
　　 (6)CD45斷裂基因(CD45-B17)真核表達(dá)載體的構(gòu)建。
　　 由于CD45基因亞型真核表達(dá)載體較大,轉(zhuǎn)染后CHO穩(wěn)定轉(zhuǎn)染建系較困難。為了提高轉(zhuǎn)染效率,建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CD45基因的細(xì)胞系,并進(jìn)一

17、步鑒定3A4抗體識別的抗原表位,我們又構(gòu)建了5個CD45斷裂基因真核表達(dá)載體pcDNA3.1+／CD45RA—B17、pcDNA3.1+／CD45RC—B17、pcDNA3.1+／CD45RBC-B17、pcDNA3.1+／CD45RAB—B17和pcDNA3.1+／CD45RABC-B17。
　　 CD45基因的16號外顯子序列是編碼跨膜區(qū)的,在17號外顯子中插入一個終止密碼子TAG,構(gòu)建從CD45的起始密碼子至17號外顯子(

18、包括跨膜區(qū)編碼序列)的真核表達(dá)載體,使CD45蛋白翻譯提前終止,形成只包括胞外區(qū)和跨膜區(qū)的斷裂蛋白。CD45基因序列僅在10號外顯子中存在一個BsrGⅠ的酶切位點(diǎn),我們利用PCR在17號外顯子中引入一個終止密碼子TAG和XhoⅠ酶切位點(diǎn),構(gòu)建自BsrGⅠ酶切位點(diǎn)至XhoⅠ酶切位點(diǎn)的TA克隆(pCR(R)-2.1／B17),然后將pCR(R)-2.1／B17和pcDNA3.1+／CD45RA、pcDNA3.1+／CD45RBC、pcDNA

19、3.1+／CD45RAB、pcDNA3.1+／CD45RABC利用BsrGⅠ和XhoⅠ雙酶切后連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH50α,挑取克隆搖菌擴(kuò)增后抽提質(zhì)粒DNA經(jīng)酶切及測序鑒定為目的基因,至此分別得到真核表達(dá)載體pcDNA3.1+／CD45RA-B17、pcDNA3.1+／CD45RBC—B17、pcDNA3.1+／CD45RAB-B17和pcDNA3.1+／CD45RABC-B17。
　　 將pCR(R)-2.1／CD4

20、5RC-1和pcDNA3.1+／CD45RBC-B17用HindⅢ和AfeⅠ雙酶切后連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α,挑取克隆搖菌擴(kuò)增后抽提質(zhì)粒DNA經(jīng)酶切及測序鑒定為目的基因,至此得到真核表達(dá)載體pcDNA3.1+／CD45RC-B17。
　　 (7)CD45斷裂蛋白亞型在真核細(xì)胞膜上的表達(dá)及3A4抗體識別抗原的進(jìn)一步鑒定。
　　 將空載體pcDNA3.1+以及構(gòu)建成功的真核表達(dá)載體pcDNA3.1+／CD45RA

21、-B17、pcDNA3.1+／CD45RC-B17、pcDNA3.1+／CD45RBC-B17、pcDNA3.1+／CD45RAB-B17和pcDNA3.1+／CD45RABC-B17分別搖菌擴(kuò)增,轉(zhuǎn)染級抽提試劑盒抽提質(zhì)粒,紫外分光光度計(jì)和電泳測質(zhì)粒DNA濃度和純度。然后采用LipofectamineTM2000試劑盒通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將空載體pcDNA3.1+和上述5個CD45斷裂基因亞型真核表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)染入真核細(xì)胞CHO,通過G

22、418篩選并通過多次亞克隆建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。抽提轉(zhuǎn)染后細(xì)胞總RNA,通過RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)基因的表達(dá)情況。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞膜上的CD45斷裂蛋白表達(dá)情況。通過流式細(xì)胞術(shù)及Western blot等方法鑒定3A4抗體所識別的抗原亞型。
　　 結(jié)果:
　　 (1)經(jīng)過SDS-PAGE鑒定,3A4重鏈和輕鏈分子量分別為58kDa和30kDa。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示,制備的3A4 FITC直標(biāo)抗體與KG1

23、a細(xì)胞陽性反應(yīng)率超過98％,表達(dá)峰型狹窄。
　　 (2)3A4識別的抗原在人正常外周血的T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞表面高表達(dá)(78.16±8.77％、99.31±1.01％、88.58±10.81％),單核細(xì)胞表面部分表達(dá)(39.39±12.28％),而中性粒細(xì)胞表面不表達(dá)(2.07±0.35％)。對PHA活化的外周血T淋巴細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn),隨著活化時間的延長,3A4識別的抗原表達(dá)減少。對30例(B系A(chǔ)LL14例,T系A(chǔ)

24、LL5例,.AML11例)初診白血病患者骨髓中的白血病細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析后發(fā)現(xiàn),進(jìn)口CD45RA的陽性率低于3A4。
　　 (3)流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)3A4識別的抗原在KG1a、Raji和U937細(xì)胞上均為高表達(dá),Molt-3細(xì)胞上低表達(dá),而Nalm-6、K562和HL60細(xì)胞不表達(dá)。分別以細(xì)胞系U937、KG1a、Raji、Molt-3、Nalm-6、K562和HL60 cDNA為模板,以CD45-1上下游引物擴(kuò)增CD45序

25、列的外顯子2至外顯子8的部分序列(CD45-1)。PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳、切膠純化、TA克隆并經(jīng)測序鑒定結(jié)果表明,這7種細(xì)胞系均有多個CD45-1基因亞型。U937和KG1a表達(dá)CD45RABC-1和CD45RBC-1,Raji表達(dá)CD45RABC-1、CD45RBC-1和CD45RB-1(微量),Nalm-6表達(dá)微量的CD45RABC-1、CD45RBC-1、CD45RB-1和CD45RO-1,Molt-3表達(dá)CD45RAB-1

26、、CD45RBC-1、CD45RB-1和CD45RO-1,K562和HL60(微量)表達(dá)CD45RB-1和CD45RO-1。Western Blot結(jié)果表明,3A4抗體識別的抗原大小為200kDa左右,Raji和KG1a細(xì)胞裂解液中均有豐富的3A4抗體識別的抗原,而K562和Nalm-6細(xì)胞裂解液中未檢測到3A4抗體識別的抗原。
　　 (4)真核表達(dá)載體pcDNA3.1+／CD45RA、pcDNA3.1+／CD45RBC、pcD

27、NA3.1+／CD45RAB和pcDNA3.1+／CD45RABC擴(kuò)增提取質(zhì)粒DNA后經(jīng)酶切及測序鑒定分別包含相應(yīng)的目的基因片段CD45RA(3714bp)、CD45RBC(3801bp)、CD45RAB(3855bp)和CD45RABC(3999bp),表明該4個CD45基因真核表達(dá)載體已構(gòu)建成功。
　　 (5)構(gòu)建成功的4個CD45基因真核表達(dá)載體和空載體分別轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞CHO,然后按照測定的CHO細(xì)胞對G418的死亡曲線,

28、以600μg／ml的G418篩選濃度進(jìn)行持續(xù)加壓篩選。轉(zhuǎn)染后細(xì)胞分別命名為CD45RA-CHO、CD45RBC-CHO、CD45RAB-CHO和CD45RABC-CHO。2-3周后進(jìn)行目的基因及蛋白表達(dá)檢測。RT-PCR結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后的各亞型CD45-CHO細(xì)胞中CD45-1基因大小均與理論序列相符合,表明目的基因在基因水平有表達(dá)。通過流式細(xì)胞術(shù)在蛋白水平檢測到CD45抗原在CD45-CHO細(xì)胞膜上成功表達(dá)。
　　 (6)流式細(xì)

29、胞術(shù)結(jié)果顯示3A4能夠識別CD45RBC-CHO和CD45RABC-CHO細(xì)胞上的抗原。Western Blot顯示3A4識別CD45RBC-CHO和CD45RABC-CHO細(xì)胞裂解液中200kDa左右的蛋白質(zhì),而CD45RA-CHO和CD45RAB-CHO細(xì)胞上未檢測到3A4抗體識別的抗原。
　　 (7)由于CD45基因亞型真核表達(dá)載體較大(近10000bp),轉(zhuǎn)染后CHO穩(wěn)定轉(zhuǎn)染建系較困難。傳代第5～6次以后陽性細(xì)胞數(shù)便低于

30、10％。尚未能建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。為了提高轉(zhuǎn)染效率,建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CD45基因的細(xì)胞系,并進(jìn)一步鑒定3A4抗體識別的抗原表位,我們又構(gòu)建了5個CD45斷裂基因真核表達(dá)載體pcDNA3.1+／CD45RA—B17、pcDNA3.1+／CD45RC-B17、pcDNA3.1+／CD45RBC—B17、pcDNA3.1+／CD45RAB-B17和pcDNA3.1+／CD45RABC-B17。這5個表達(dá)載體擴(kuò)增提取質(zhì)粒DNA后經(jīng)酶切及測序鑒定分別

31、包含相應(yīng)的目的基因片段CD45RA-B17(1583bp)、CD45RC-B17(1529bp)、CD45RBC-B17(1670bp)、CD45RAB-B17(1724bp)和CD45RABC-B17(1868bp),表明這5個CD45斷裂基因真核表達(dá)載體已構(gòu)建成功。
　　 (8)構(gòu)建成功的5個CD45斷裂基因真核表達(dá)載體和空載體分別轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞CHO,然后以600μg／ml的G418篩選濃度進(jìn)行持續(xù)加壓篩選。轉(zhuǎn)染后細(xì)胞分別命

32、名為CD45RA-B17-CHO、CD45RC-B17-CHO、CD45RBC-B17-CHO、CD45RAB-B17-CHO和CD45RABC—B17-CHO。2-3周后進(jìn)行目的基因及蛋白表達(dá)檢測。RT-PCR結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后的各亞型CD45-B17-CHO細(xì)胞中CD45斷裂基因大小均與理論序列相符合,表明目的基因在基因水平有表達(dá)。通過流式細(xì)胞術(shù)在蛋白水平檢測到CD45斷裂蛋白在CD45-B17-CHO細(xì)胞膜上成功表達(dá)。
　　

33、(9)流式細(xì)胞術(shù)和細(xì)胞免疫熒光顯示3A4能夠識別CD45RC-B17-CHO、CD45RBC-B17-CHO和CD45RABC-B17-CHO細(xì)胞上的抗原。Western Blot結(jié)果3A4識別CD45RC-B17-CHO、CD45RBC-B17-CHO和CD45RABC-B17-CHO細(xì)胞裂解液中70kDa左右的蛋白質(zhì),而CD45RA-B17-CHO和CD45RAB—B17-CHO細(xì)胞上未檢測到3A4抗體識別的抗原。
　　 (

34、10)通過G418篩選建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系,其中CD45RBC-B17-CHO和CD45RC-B17-CHO建系成功。
　　 結(jié)論:
　　 (1)3A4識別的抗原主要分布在T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、單核細(xì)胞膜,而中性粒細(xì)胞膜上不表達(dá)。
　　 (2)成功構(gòu)建pcDNA3.1+／CD45RA、pcDNA3.1+／CD45RAB、pcDNA3.1+／CD45RBC和pcDNA3.1+／CD45RABC及pcDNA3.1+

35、／CD45RA—B17、pcDNA3.1+／CD45RC-B17、pcDNA3.1+／CD45RAB—B17、pcDNA3.1+／CD45RBC-B17和pcDNA3.1+／CD45RABC-B17真核表達(dá)載體。在基因水平和蛋白水平檢測到轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞成功,CD45均能在CHO細(xì)胞膜上成功表達(dá)。其中CD45RBC-B17-CHO和CD45RC-B17-CHO獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。
　　 (3)3A4能夠識別轉(zhuǎn)染CD45基因的細(xì)胞C