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1、目的:利用噬菌體肽庫(kù)展示技術(shù)從Ph.D.12噬菌體肽庫(kù)中篩選能夠和人CD55單克隆抗體(CD55 McAb)特異性結(jié)合的短肽,從中找到CD55的抗原模擬表位,設(shè)計(jì)出與人腫瘤免疫逃逸蛋白CD55同源的的短肽,為腫瘤治療奠定理論基礎(chǔ)。
方法:以人CD55單克隆抗體為靶標(biāo),Ph.D.12肽庫(kù)通過(guò)4輪噬菌體篩選淘選出與CD55單克隆抗體特異性結(jié)合的短肽,計(jì)算每輪回收率。4輪篩選后,隨機(jī)挑選11個(gè)噬菌體單克隆和野生型噬菌體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合,
2、計(jì)算其結(jié)合力。利用ELISA、競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)鑒定篩選出結(jié)合力強(qiáng)的噬菌體單克隆,E.coliER2378宿主菌表達(dá)和純化噬菌體。將陽(yáng)性噬菌體克隆交由公司測(cè)序,測(cè)序結(jié)果里找出出現(xiàn)頻率高的短肽序列,設(shè)計(jì)與人CD55單克隆抗體具有高親和性及特異性的短肽,并對(duì)其體外抗乳腺癌作用效果進(jìn)行研究。CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CD55抗原模擬表位對(duì)乳腺癌細(xì)胞(MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞)增殖的影響。熒光顯微鏡驗(yàn)證短肽在細(xì)胞中的攝入和分布。透射電鏡(Trans
3、mission electron microscopy, TEM)和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)該短肽在乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞凋亡中的影響。
結(jié)果:4輪篩選后,每輪噬菌體回收率都達(dá)到了較高數(shù)量級(jí)。競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示11個(gè)噬菌體單克隆和第3、4輪篩選后的噬菌體都與CD55單克隆抗體親和力都非常顯著。ELISA結(jié)果顯示有8個(gè)噬菌體單克隆和CD55單克隆抗體親和力顯著。根據(jù)測(cè)序結(jié)果得到兩條高表達(dá)短肽序列 HAHTPT
4、RGVMHA(簡(jiǎn)稱 H肽)和QVNGLGERSQQM(簡(jiǎn)稱Q肽)。CCK8實(shí)驗(yàn)證明Q短肽序列對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞的毒性作用顯著且具有劑量依賴性,而H短肽較Q肽藥效較差,達(dá)到相同抑瘤率所需作用濃度較高。熒光顯微鏡觀察到Q短肽分布在細(xì)胞膜表面。透射電鏡和流式細(xì)胞術(shù)顯示Q短肽具有誘導(dǎo)MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞凋亡的作用。
結(jié)論:利用噬菌體隨機(jī)12肽庫(kù)成功得到兩條CD55單克隆抗體特異性結(jié)合的CD
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