四種藥用野生蕨類植物的組織培養(yǎng)研究.pdf

1、藥用蕨類植物一直作為傳統(tǒng)中藥被沿用至今。隨著新技術新方法在植物藥用成分分離分析上的應用,越來越多蕨類植物所含的藥用成分被發(fā)現(xiàn),人們對藥用蕨類植物的需求也正愈來增加。由于被肆意開采、其生態(tài)環(huán)境正被嚴重破壞,許多野生藥用蕨類植物種類面臨滅絕的厄運,更滿足不了中藥材市場的需求。組織培養(yǎng)為野生藥用蕨類植物基礎研究、保護和開發(fā)利用提供必要的手段。本文從4種藥用鳳尾蕨屬(Pteris L.)植物的成熟孢子組織培養(yǎng)開始,利用組織培養(yǎng)技術、顯微攝像、制

2、片技術等實驗手段,研究其配子體(Gametophyte,G)發(fā)育、配子體增殖和配子體愈傷組織及孢子體誘導等；其中大半邊旗(Pteris dissitifolia Bak.)和傅氏鳳尾蕨(Pteris fauriei Hieron.)配子體在不含植物激素培養(yǎng)基中形成的愈傷組織誘導胚狀體(Embryoid,E)形態(tài)發(fā)生的組織細胞學觀察,是國內(nèi)首次對蕨類植物胚狀體進行的研究。主要結論如下：(1)大半邊旗(Pteris dissitifolia

3、 Bak.)大半邊旗成熟孢子在1/2 MS和1/2 MS大量元素兩種固體培養(yǎng)基中都能萌發(fā)并最終形成孢子體。在1/2 MS大量元素+1%(w/v)蔗糖的培養(yǎng)基中,孢子萌發(fā)為書帶蕨型(Vittaria-type),配子體發(fā)育為水蕨型(Ceratopteris-type)。植物激素誘導配子體形成粘質(zhì)、水浸狀的黃綠色愈傷組織(Callus,C),但這些愈傷組織在GA3 0.1mg·L-1 +1/2 MS大量元素+3%蔗糖的固體培養(yǎng)基中不能分化形

4、成孢子體。孢子在1/2 MS大量元素+1%蔗糖的固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)約11周形成的配子體,其中有些配子體上形成一些乳白色的愈傷組織。這些愈傷組織能在GA3 0.1mg·L-1 +1/2 MS大量元素+3%蔗糖的固體培養(yǎng)基中分化形成胚狀體,最終發(fā)育成完整的孢子體苗。組織細胞學觀察發(fā)現(xiàn),胚狀體形態(tài)發(fā)生過程具有類似合子胚胎發(fā)育的四細胞期(Quadrant stage)、球形胚胎(Spherical-shaped embryo stage)、心形胚

5、(Heart-shaped embryo stage)、魚雷胚(Torpedo-shaped embryo stage)、成熟胚胎(Mature embryo)各階段；胚狀體發(fā)育早期就出現(xiàn)極性(Polarity)和管狀分子(Tracheary elements,Tes)；同一培養(yǎng)物上可以看到不同發(fā)育時期和不同大小的胚狀體。(2)傅氏鳳尾蕨(Pteris fauriei Hieron.)在1/2MS固體培養(yǎng)中,傅氏鳳尾蕨孢子萌發(fā)方式為書帶

6、蕨型,配子體發(fā)育是有些類似三叉蕨型(Aspidium-type)的一種,近成熟配子體腹面近凹口處分生區(qū)處有一個由許多顆粒狀細胞組成并長有許多多細胞毛狀體的突起結構,極少數(shù)配子體上此突起部位發(fā)現(xiàn)個別頸卵器(Archegonia)。孢子萌發(fā)和配子體發(fā)育都能耐受較大變化的酸性培養(yǎng)環(huán)境。傅氏鳳尾蕨配子體形成孢子體都與上述突起結構有關；在無激素的1/2MS固體培養(yǎng)條件下,該結構除了長出極少數(shù)孢子體外,還形成愈傷組織且隨著培養(yǎng)基中蔗糖濃度的增加(0

7、~3%)而增多。溫差(12h 15℃, 12h 25℃)使以上形成的愈傷組織生長減慢,質(zhì)地變硬,顏色變白；這些愈傷組織能在GA3 0.1mg·L-1 +1/2MS大量元素+3%蔗糖的固體培養(yǎng)基中形成大量的胚狀體最終發(fā)育成大量的孢子體；對這些愈傷組織及其正在分化培養(yǎng)基中形成的胚狀體進行組織細胞學觀察,發(fā)現(xiàn)有類似胚胎發(fā)育過程的各個階段。而在1/2MS大量元素+6-BA 0.5 mg·L-1 + NAA 0.5 mg·L-1 +3%蔗糖的固體

8、培養(yǎng)基中這些愈傷組織能增殖,繼續(xù)培養(yǎng)只長出不定根,只有移植到以上含GA3 0.1mg·L-1的固體培養(yǎng)基中才能長出許多不定根和不定芽。(3)井欄邊草(Pteris Muldifida Poir.)成熟的井欄邊草孢子在以下幾種固體無菌培養(yǎng)基中,都能萌發(fā)形成配子體并增殖呈繡球狀：①在1/2MS大量元素+1%蔗糖的培養(yǎng)基中約8周可肉眼看到片狀體,但萌發(fā)率較低,約4個月長出孢子體；②在1/2MS+3%蔗糖的培養(yǎng)基中6周可肉眼看到片狀體,萌發(fā)率很

9、低,未能形成孢子體；③在1/2MS無糖的培養(yǎng)基中5周可肉眼看到片狀體,萌發(fā)率最高,約5個月長出孢子；④在含3%蔗糖的MS培養(yǎng)基中的一些配子體能形成暗黃透明狀的愈傷組織,未能形成孢子體。井欄邊草配子體能耐受較大變化的酸性培養(yǎng)環(huán)境。含0.5~4.0 mg·L-1的NAA和0.5~2.0 mg·L-1的6-BA液體培養(yǎng)能促進配子體增殖,其中以4.0 mg·L-1的NAA和2.0 mg·L-1的6-BA配比最佳。配子體液體增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)的配子

10、體在轉移到1/2MS固體培養(yǎng)基上能增殖并長出孢子體,而在MS固體培養(yǎng)基上卻只增殖不長孢子體。這些配子體于激素誘導培養(yǎng)基中形成的愈傷組織在GA3 0.1mg·L-1 +3%蔗糖的1/2MS大量元素固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)未能分化出孢子體。(4)巖鳳尾蕨(Pteris deltodon Bak.)巖鳳尾蕨成熟孢子接種到1/2MS +1%蔗糖+ pH6.5固體培養(yǎng)基,2周左右開始萌發(fā),孢子萌發(fā)類型為書帶蕨型,配子體發(fā)育類型為水蕨型,配子體約在第12周