人牙髓側(cè)群細胞生物學特性及體外誘導(dǎo)分化研究.pdf

1、2000年Gronthos等首次發(fā)現(xiàn)具有克隆形成能力和多向分化能力的牙髓干細胞(Dental pulp stem cells，DPSCs)以來，DPSCs逐漸成為干細胞領(lǐng)域的一個研究熱點。然而，牙髓干細胞的異質(zhì)性以及缺乏特異性表面標記已成為DPSCs研究的瓶頸。1996年，Goodell等在用Hoechst33342染色法研究全骨髓時，發(fā)現(xiàn)有極少一部分細胞可以將進入細胞核的熒光染料排出胞外，在熒光顯微鏡下觀察或流式細胞檢測時表現(xiàn)為不著色

2、，他們將這類細胞命名為側(cè)群細胞(Side population，SP)。通過具有355nm紫外激發(fā)裝置的流式細胞儀就可以將這部分細胞檢測或分選出來。SP表型是由ABC轉(zhuǎn)運蛋白家族(ATP-binding cassette transporter superfamily)介導(dǎo)的，其中一個主要的介導(dǎo)分子為ABCG2(ATP-binding cassette，sub-family G，member2)或BCRP(Breast cancer r

3、esistance protein)。目前SP分選技術(shù)已被大量運用于腫瘤干細胞的分離。研究發(fā)現(xiàn)SP細胞還存在于多種生物的正常組織，如臍血、骨骼肌、骨、肺、肝、胰腺、表皮細胞、前腦、睪丸、心臟、腎臟、角膜上皮緣、前列腺、唾液腺、乳腺等。這些SP細胞大多具有干細胞特性如自我更新和多向分化能力。還有研究表明豬牙髓細胞中可以分離得到具有多向分化能力的SP細胞，人牙髓細胞，牙周細胞中也檢測到少量SP表型。
　　 本研究的目的旨在對人牙髓細

4、胞進行SP表型鑒定，探討體外缺血培養(yǎng)對牙髓SP表型的影響。分離培養(yǎng)人牙髓SP細胞，體外誘導(dǎo)其向成牙本質(zhì)/成骨、成脂、成神經(jīng)、成血管內(nèi)皮方向分化，并檢測牙髓SP細胞的生物學特性，為SP分選應(yīng)用于人牙髓干細胞的分離和純化奠定基礎(chǔ)。
　　 第一章：人牙髓細胞體外培養(yǎng)及SP鑒定。
　　 目的：從人健康恒牙及乳牙牙髓組織中分離、培養(yǎng)牙髓細胞，檢測第2代DPCs中SP含量，ABCG2的表達情況，結(jié)合ABCG2在牙髓組織中的定位，分析

5、ABCG2表達對維持牙髓SP細胞表型所起作用。
　　 方法：酶消化法原代培養(yǎng)人恒牙及乳牙牙髓細胞。Hoechst33342染色后，流式細胞儀檢測恒牙牙髓細胞和乳牙牙髓細胞中SP比例。用ABCG2抗體進行免疫熒光染色，定位ABCG2在人牙髓細胞中的表達。采用熒光定量RT-PCR檢測兩種細胞中ABCG2基因表達水平。免疫組化染色確定ABCG2在正常和炎癥牙髓組織中的表達。
　　 結(jié)果：體外培養(yǎng)的恒牙和乳牙牙髓細胞中均檢測到S

6、P細胞，其中恒牙SP比例約占1％，乳牙SP約為2％。免疫熒光結(jié)果顯示ABCG2表達在牙髓細胞的胞膜。熒光定量RT-PCR檢測到兩種牙髓細胞均有ABCG2基因表達，其中乳牙牙髓細胞略高于恒牙牙髓細胞(p＜0.05)。免疫組化染色顯示ABCG2在正常牙髓中主要表達于血管周和成牙本質(zhì)細胞層，而在炎癥牙髓組織中可見ABCG2+細胞增多。
　　 結(jié)論：人恒牙和乳牙牙髓細胞中均可檢測到SP細胞及其標志物ABCG2的表達，其中乳牙牙髓SP比例

7、稍高。ABCG2在正常牙髓組織定位于血管周和成牙本質(zhì)細胞層，炎癥牙髓組織中ABCG2表達增高。
　　 第二章：體外缺血培養(yǎng)對牙髓SP的影響。
　　 目的：本部分將在體外模擬缺血培養(yǎng)牙髓細胞，檢測缺血培養(yǎng)對牙髓SP表型，SP標志ABCG2及干細胞標志Oct4的影響。
　　 方法：確定體外模擬缺血條件(2％O2 and2％FBS)，實驗分三組：正常組，24h缺血組，48h缺血組。MTT法檢測缺血培養(yǎng)對牙髓細胞增殖的影

8、響。流式細胞儀檢測正常組，24h和48h缺血組SP細胞比例。細胞免疫熒光檢測三個實驗組中ABCG2與Oct4的蛋白表達。熒光定量RT-PCR檢測各組ABCG2和Oct4mRNA表達。
　　 結(jié)果：MTT檢測數(shù)據(jù)顯示從5-7天開始，缺血組細胞增殖與正常組相比呈明顯抑制趨勢(p＜0.05)，尤其是48h缺血組(p＜0.01)。流式檢測發(fā)現(xiàn)不同培養(yǎng)條件下牙髓細胞中SP含量明顯不同，缺血組SP比例較正常組增高。其中48h缺血組中SP細胞

9、的含量約為5％，24h缺血組中含2％SP細胞，而對照組中僅有1％。細胞免疫熒光結(jié)果提示24h和48h缺血組中ABCG2+、Oct4+細胞較正常組增多，其中24h缺血組ABCG2+細胞數(shù)與正常組相比差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)，48h缺血組與正常組相比差異更顯著(p＜0.01)，同時48h缺血組Oct4+細胞數(shù)與正常組相比差異也較顯著(p＜0.01)。熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示48h缺血組ABCG2和Oct4基因表達水平均明顯高于其

10、余兩組(p＜0.01)。
　　 結(jié)論：短期體外缺血培養(yǎng)可以促進人牙髓SP細胞及其標志物ABCG2的表達。同時還可提高干細胞標志Oct4的表達。
　　 第三章：牙髓SP細胞體外多向分化能力檢測。
　　 目的：通過流式分選得到人牙髓SP及MP細胞，并進行體外多向分化(成牙本質(zhì)/成骨，成脂，成神經(jīng)，成血管內(nèi)皮)誘導(dǎo)，觀察牙髓SP細胞是否具有良好的多向分化潛能。
　　 方法：通過流式細胞儀分離獲得牙髓SP和MP細

11、胞。體外誘導(dǎo)牙髓SP和MP細胞向成牙本質(zhì)/成骨分化，誘導(dǎo)14d后，茜素紅染色觀察礦化基質(zhì)的形成。熒光定量RT-PCR檢測成牙本質(zhì)/成骨標志基因DSPP，DMP-1的表達。體外誘導(dǎo)牙髓SP和MP細胞向成脂分化，培養(yǎng)21d后，油紅O染色。熒光定量RT-PCR檢測成脂標志基因PPARγ2與LPL表達。體外誘導(dǎo)牙髓SP和MP細胞神經(jīng)分化，誘導(dǎo)培養(yǎng)4天后，細胞免疫熒光法檢測NSE表達。熒光定量RT-PCR檢測神經(jīng)細胞標志基因NSE和NEF的表達。

12、體外誘導(dǎo)牙髓SP和MP細胞向血管內(nèi)皮分化，分化培養(yǎng)7天的細胞進行Matrivgel管狀形成試驗，熒光定量RT-PCR檢測內(nèi)皮細胞標志基因vWF，CD31的表達。
　　 結(jié)果：成牙本質(zhì)/成骨誘導(dǎo)：茜素紅染色顯示SP細胞誘導(dǎo)兩周后形成的礦化基質(zhì)較MP細胞多，相關(guān)基因DSPP與DMP-1的表達量SP細胞明顯高于MP細胞(p＜0.01)。成脂誘導(dǎo)分化：油紅O染色顯示SP細胞誘導(dǎo)三周后形成細胞內(nèi)脂滴較MP細胞大且多，相關(guān)基因PPARγ2與

13、LPL的表達量SP細胞明顯高于MP細胞(p＜0.01)。成神經(jīng)誘導(dǎo)分化：誘導(dǎo)2d后SP細胞發(fā)生極化，細胞突起形成，誘導(dǎo)4d后免疫熒光染色顯示SP細胞NSE呈強陽性，MP細胞表達陰性。成神經(jīng)誘導(dǎo)后相關(guān)基因NSE與NEF的表達量SP細胞明顯高于MP細胞(p＜0.01)。成血管內(nèi)皮誘導(dǎo)分化：誘導(dǎo)7d后SP細胞在Matrivgel膠上形成二維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，MP細胞未見成管。成血管內(nèi)皮誘導(dǎo)后相關(guān)基因vWF與CD31的表達量SP細胞明顯高于MP細胞(p

14、＜0.01)。
　　 結(jié)論：人牙髓SP細胞在體外具備成牙本質(zhì)/成骨、成脂、成神經(jīng)和成內(nèi)皮的多向分化潛能，有望成為組織工程新的種子細胞。
　　 第四章：人牙髓SP細胞生物學特性研究。
　　 目的：為進一步證實人牙髓SP細胞的干細胞特性，本實驗對分離得到的SP和MP細胞進行了相關(guān)的生物學特性檢測，包括克隆形成實驗、干細胞相關(guān)基因表達檢測以及SP細胞長期分化實驗。
　　 方法：通過流式細胞儀分離獲得牙髓SP和M

15、P細胞?？寺⌒纬蓪嶒灆z測牙髓SP和MP細胞克隆形成能力。熒光定量RT-PCR檢測七個干細胞相關(guān)基因在SP和MP細胞表達水平。收集分選后傳至第三代，第六代和第九代的SP細胞，通過流式細胞儀和Western Blot檢測ABCG2蛋白表達，實時熒光定量RT-PCR檢測ABCG2基因表達。
　　 結(jié)果：SP細胞的集落形成率(5.3士0.8)％，明顯高于MP細胞(0.6士0.2)％(p＜0.01)。熒光定量RT-PCR檢測結(jié)果顯示7個干

16、細胞相關(guān)基因Tert，SDF-1，α-SMA，Oct4，Bmil，CD146和Stat3在人牙髓SP細胞中的表達遠遠高于MP細胞。流式細胞儀對第三代，第六代和第九代人牙髓SP細胞表面ABCG2表達分析，結(jié)果顯示隨傳代次數(shù)增加細胞表面ABCG2蛋白表達量逐漸減少。Western blot結(jié)果也證實ABCG2蛋白在SP細胞傳代過程中各時相表達有差異。熒光定量PCR結(jié)果表明各代SP細胞ABCG2mRNA變化趨勢與ABCG2蛋白基本一致。