聯(lián)合共培養(yǎng)系統(tǒng)誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞定向分化視網(wǎng)膜色素上皮細胞研究.pdf

1、目的：探討添加腦源性神經(jīng)生長因子(brain—derired neurotrophic factorBDNF)、表皮生長因子(epidermal growth factor EGF)、堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor bFGF)培養(yǎng)基聯(lián)合人類視網(wǎng)膜色素上皮(human retinal pigment epithe-lialium,HRPE)細胞共培養(yǎng)對骨髓間充質(zhì)細胞(bone marr

2、ow stromal cells.BMSCs)定向誘導(dǎo)分化的影響。
　　 方法：實驗分3組:HRPE+BDNF、EGF、bFGF+BMSCs共培養(yǎng)組、BDNF、EGF、bFGF+BMSCs共培養(yǎng)組,和對照組(單獨BMSCs)。體外培養(yǎng)人視網(wǎng)膜色素上皮細胞(HRPE)和大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs),取第3代HRPE和第3代BMSCs接種于Transwell雙層培養(yǎng)板內(nèi)共培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化,采用免疫細胞化學(xué)

3、染色、RT—PCR檢測角蛋白18、RPE65蛋白在誘導(dǎo)細胞中的表達。隨后把誘導(dǎo)后細胞和人視網(wǎng)膜光感受器細胞再次共培養(yǎng)2d,第二天倒置相差顯微鏡下觀察細胞吞噬現(xiàn)象,采用RT—PCR檢測光感受器特異性標志視紫紅質(zhì)(Rhodopsin)在誘導(dǎo)細胞中的表達,單獨培養(yǎng)誘導(dǎo)后細胞檢測上清液中PEDF水平。
　　 結(jié)果：共培養(yǎng)2 w后的細胞置倒置相差顯微鏡下觀察:HRPE+BDNF、EGF、bFGF+BMSCs共培養(yǎng)組在誘導(dǎo)14 d后,BMS

4、Cs出現(xiàn)明顯胞體由原來的纖維細胞外觀變?yōu)閳A形、橢圓形,胞漿內(nèi)出現(xiàn)色素顆粒。出現(xiàn)類似RPE細胞樣外觀。而另外兩組分化細胞明顯較少,胞體基本沒有變化,胞漿內(nèi)也未見色素顆粒樣改變；免疫細胞化學(xué)染色顯示:HRPE+BDNF、EGF、bFGF+BMSCs共培養(yǎng)組能誘導(dǎo)BMSCs更多的表達角蛋白18(OD:0.527±0.029)、RPE65(OD:0.326±0.019)。將三種培養(yǎng)條件下所表達的陽性細胞分別進行統(tǒng)計學(xué)分析,組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

5、角蛋白18:t=38.611、37.532、P<0.05; RPE65:t=37.416、36.236、P<0.05)。RT—PCR的鑒定結(jié)果顯示同樣結(jié)果。對誘導(dǎo)后的細胞吞噬功能和分泌PEDF功能檢測顯示誘導(dǎo)后的可以吞噬感光細胞脫落的外節(jié)膜盤結(jié)構(gòu)。單獨培養(yǎng)誘導(dǎo)后的細胞上清液中可以檢測到PEDF陽性。
　　 結(jié)論：HRPE+BDNF、EGF、bFGF+BMSCs共培養(yǎng)可以誘導(dǎo)BMSCs向視網(wǎng)膜色素上皮細胞分化。人BMSCs細胞在和