阿爾茨海默病大鼠模型的磁共振、行為學(xué)、電生理、形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)研究.pdf

1、目的：
　　阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）是一種嚴(yán)重影響老年人身體健康的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，起病隱匿，主要表現(xiàn)為進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙、學(xué)習(xí)和記憶能力喪失，晚期出現(xiàn)嚴(yán)重的癡呆。目前我國(guó)癡呆患者的人數(shù)約600萬(wàn)，居世界第一位。而且隨著人口老齡化的加劇，AD的發(fā)病率和患者人數(shù)還會(huì)持續(xù)增加，因此，對(duì)于 AD的早期診斷和治療具有重要的臨床意義。同時(shí)，目前臨床工作中常常根據(jù)臨床表現(xiàn)結(jié)合磁共振成像內(nèi)側(cè)顳葉萎縮視

2、覺(jué)量表診斷AD。但是，只有中、晚期AD患者才會(huì)出現(xiàn)腦萎縮改變，如何在AD患者出現(xiàn)臨床癥狀和腦組織形態(tài)改變之前早期發(fā)現(xiàn)和診斷AD，目前尚無(wú)有效方法。
　　AD的典型病理特征包括高密度老年斑、神經(jīng)原纖維纏結(jié)和神經(jīng)元喪失。老年斑的核心成分是由39-43個(gè)氨基酸組成的β-淀粉樣蛋白（β-amyloid peptides, Aβ）。大量研究表明，Aβ分子的產(chǎn)生和異常沉積是 AD發(fā)病的始動(dòng)因素，AD病程中所出現(xiàn)的神經(jīng)原纖維纏結(jié)的形成和神經(jīng)元死

3、亡等一系列過(guò)程，均是Aβ所引起的繼發(fā)過(guò)程。此外，位于19號(hào)染色體的載脂蛋白E4（apolipoprotein E4, APOE4）基因是AD的主要危險(xiǎn)因子，APOE4基因過(guò)表達(dá)后的產(chǎn)物apoE4也已經(jīng)被證明具有較強(qiáng)的神經(jīng)毒性，并與AD的發(fā)生發(fā)展有著不可忽視的關(guān)系。同時(shí)，不僅Aβ和apoE4本身具有神經(jīng)毒性作用，apoE4和Aβ之間還具有協(xié)同作用，能夠進(jìn)一步加重AD的發(fā)生發(fā)展。
　　磁共振成像（magnetic resonance

4、imaging, MRI）是一種具有極高的軟組織分辨力，廣泛應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究與診斷的影像學(xué)檢查手段。Morris水迷宮是在神經(jīng)科學(xué)研究中廣泛應(yīng)用的，能夠有效反映動(dòng)物的認(rèn)知功能改變和衡量動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶功能的經(jīng)典行為學(xué)實(shí)驗(yàn)手段。海馬長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)（long-term potentiation, LTP）則是研究學(xué)習(xí)記憶和AD發(fā)病機(jī)制的一個(gè)重要的電生理細(xì)胞模型。已有研究發(fā)現(xiàn)Aβ1-40可以直接引起大鼠側(cè)腦室擴(kuò)大、磁共振波譜成像化合物濃度改變

5、、損傷大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力和壓抑LTP的誘導(dǎo)和維持；還有研究表明人類APOE4基因目標(biāo)替換小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力和工作記憶能力均有不同程度的損傷，海馬腦片 LTP被明顯壓抑。但目前仍缺乏Aβ和apoE4共同作用的影像學(xué)表現(xiàn)特點(diǎn)、對(duì)空間學(xué)習(xí)記憶能力和海馬突觸可塑性影響的報(bào)道，尤其是缺乏在同一動(dòng)物模型先后進(jìn)行磁共振、行為學(xué)、電生理和形態(tài)學(xué)等多種不同檢查和實(shí)驗(yàn)，從不同角度闡述AD相關(guān)病變，并最終從病理學(xué)角度證實(shí)AD的相關(guān)研究。
　　本研

6、究利用磁共振檢查、Morris水迷宮行為學(xué)檢測(cè)和在體場(chǎng)電位記錄，結(jié)合相關(guān)的形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)檢測(cè)手段，通過(guò)在造模前和造模后不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)三種不同AD模型的T2值、1H-MRS指標(biāo)變化，同時(shí)觀察其空間學(xué)習(xí)記憶能力和突觸可塑性的改變，并最終進(jìn)行病理學(xué)相關(guān)檢測(cè)，探討不同AD模型磁共振、行為學(xué)、電生理、形態(tài)學(xué)的變化及其關(guān)系。通過(guò)對(duì)三種不同AD模型先后采用多種手段從不同角度檢測(cè)其AD相關(guān)病變，特別是觀察不同AD大鼠模型磁共振影像學(xué)變化特點(diǎn)，希望有

7、助于進(jìn)一步認(rèn)識(shí)AD病程中各種病變的發(fā)生發(fā)展及其相互聯(lián)系，從而為AD早期診斷的準(zhǔn)確性和敏感性提供新的依據(jù)和方法。
　　方法：
　　以側(cè)腦室單獨(dú)注射Aβ1-40或apoE4、以及聯(lián)合注射Aβ1-40和apoE4三種方法制備的AD模型大鼠為研究對(duì)象。將60只大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、Aβ1-40組、ApoE4組和聯(lián)合給藥組，每組15只。利用磁共振多回波序列和波譜成像技術(shù)，在給藥前、給藥后2周和4周對(duì)四組大鼠分別進(jìn)行頭顱MRI掃描，縱

8、向研究大鼠海馬T2值和1H-MRS化合物濃度的變化。利用Morris水迷宮行為學(xué)技術(shù)，在第二次磁共振檢查結(jié)束后，對(duì)各組大鼠進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)、空間探索實(shí)驗(yàn)和可視平臺(tái)實(shí)驗(yàn)，觀察大鼠搜索水下平臺(tái)的平均逃避潛伏期和游泳距離、在目標(biāo)象限游泳的時(shí)間和距離占總游泳時(shí)間和距離的百分比，以及平均游泳速度和尋找可視平臺(tái)的逃避潛伏期等指標(biāo)的變化。在水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，使用在體場(chǎng)電位記錄手段直接記錄各組大鼠海馬CA1區(qū)基礎(chǔ)fEPSPs、PPF和LTP等指標(biāo)的變化

9、，以觀察各組基礎(chǔ)突觸傳遞和突觸可塑性的變化特征。在第三次磁共振檢查結(jié)束后，從各組隨機(jī)選取部分大鼠進(jìn)行HE染色和免疫組織化學(xué)檢測(cè)，從整體上觀察各組大鼠腦的形態(tài)學(xué)改變，并觀察海馬和皮層Aβ免疫陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量。同時(shí)，從各組隨機(jī)選取部分大鼠，采用western blot技術(shù)檢測(cè)其海馬組織磷酸化tau蛋白的含量。
　　結(jié)果：
　　利用磁共振多回波序列和波譜成像技術(shù)，在給藥前后不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)四組大鼠分別進(jìn)行頭顱MRI掃描，發(fā)現(xiàn)：（1）三種

10、AD模型大鼠海馬T2值改變特點(diǎn)不同。在給藥前及給藥后2周和4周，對(duì)照組 T2值分別為80.46±3.06 ms、81.92±3.48 ms和80.72±3.47 ms，ApoE4組的T2值則分別為80.64±2.27 ms、81.20±1.67 ms和81.98±3.10 ms。ApoE4組大鼠海馬 T2值與對(duì)照組在不同時(shí)間點(diǎn)均無(wú)明顯差異，且不同時(shí)間點(diǎn)ApoE4組T2值也無(wú)差異。Aβ1-40組的 T2值在給藥前及給藥后2周和4周分別為8

11、1.70±3.10 ms、80.59±3.22 ms和91.05±3.10 ms。在給藥前和給藥后2周，Aβ1-40組與對(duì)照組 T2值均無(wú)明顯差異。但在給藥后4周，Aβ1-40組 T2值明顯高于對(duì)照組（P<0.05）。同時(shí)，Aβ1-40組大鼠在給藥后4周的T2值明顯高于本組給藥前和給藥后2周（P<0.05）。在聯(lián)合給藥組，給藥前及給藥后2周和4周，海馬T2值分別為80.86±2.74 ms、81.71±3.55 ms和95.95±1.2

12、5 ms。給藥后2周，三種AD模型大鼠的T2值與對(duì)照組均無(wú)顯著性差異；但在給藥后4周，聯(lián)合給藥組的T2值不僅明顯高于對(duì)照組，也高于單獨(dú)給予Aβ1-40或apoE4組（P<0.05）。同時(shí)，聯(lián)合給藥組在給藥后4周的 T2值明顯高于給藥前和給藥后2周（P<0.05）。（2）三種 AD大鼠模型海馬NAA/Cr+Cr1均減低，但程度不同。給藥前，對(duì)照組、Aβ1-40組、ApoE4組及聯(lián)合給藥組的NAA/Cr+Cr1分別為1.19±0.06、1.

13、15±0.12、1.16±0.05和1.16±0.07；在給藥后2周，Aβ1-40組、ApoE4組及聯(lián)合給藥組的NAA/Cr+Cr1分別為0.74±0.13、0.92±0.17和0.33±0.12，均較對(duì)照組的1.16±0.04降低（P<0.05）；給藥后4周，Aβ1-40組、ApoE4組及聯(lián)合給藥組的 NAA/Cr+Cr1分別為0.44±0.04、0.73±0.04和0.18±0.02，同樣均較對(duì)照組的1.20±0.10降低（P<0.

14、05）；且在給藥后不同時(shí)間點(diǎn)，均以聯(lián)合給藥組降低最顯著，ApoE4組降低最少。同時(shí)，三種AD大鼠模型在給藥后4周的NAA/Cr+Cr1均低于給藥后2周，給藥后2周的NAA/Cr+Cr1又低于給藥前（P<0.05）。（3）三種AD大鼠模型均有海馬 Cho/Cr+Cr1減低，但特點(diǎn)不同。在對(duì)照組，給藥前及給藥后的2周和4周，Cho/Cr+Cr1分別為1.30±0.13、1.27±0.08和1.28±0.05。在Aβ1-40組、ApoE4組及

15、聯(lián)合給藥組，給藥后2周和4周海馬 Cho/Cr+Cr1分別為1.01±0.31和0.81±0.16、0.95±0.25和0.84±0.09、0.96±0.28和0.85±0.23，與相同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組比較均明顯降低（P<0.05），但三種 AD模型之間無(wú)明顯差異。此外，在給藥后不同時(shí)間點(diǎn)（2周和4周），各AD模型組Cho/Cr+Cr1與本組給藥前相比均明顯減小（P<0.05）；同時(shí)，Aβ1-40組Cho/Cr+Cr1在給藥后4周明顯低于給

16、藥后2周（P<0.05），但ApoE4組和聯(lián)合給藥組大鼠Cho/Cr+Cr1在給藥后2周與4周相比均無(wú)明顯差異。（4）三種AD模型海馬NAA/Cho的改變特點(diǎn)不同。給藥后2周，聯(lián)合給藥組大鼠海馬NAA/Cho為0.38±0.21，明顯低于對(duì)照組的0.91±0.08（P<0.05），但 Aβ1-40組和 ApoE4組的NAA/Cho分別為0.81±0.34和1.02±0.33，與對(duì)照組無(wú)明顯差異。給藥后4周，Aβ1-40組和聯(lián)合給藥組NA

17、A/Cho分別為0.58±0.21和0.24±0.14，與對(duì)照組的0.94±0.07相比均明顯降低，且以聯(lián)合給藥組降低更為明顯（P<0.05）。同時(shí)，在給藥后2周，聯(lián)合給藥組大鼠海馬NAA/Cho與給藥前的0.91±0.21相比明顯降低（P<0.05），且降低程度與給藥后4周無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。但Aβ1-40組NAA/Cho在給藥后4周才明顯低于對(duì)照組，ApoE4組則始終與給藥前無(wú)明顯差異。
　　第二次磁共振實(shí)驗(yàn)后，進(jìn)行 Morris水

18、迷宮行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)：（1）側(cè)腦室單獨(dú)注射Aβ1-40或apoE4均明顯損傷大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力，但二者對(duì)大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力損傷的程度無(wú)明顯差別。在定位航行實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練的第1天，側(cè)腦室注射Aβ1-40或apoE4與對(duì)照組相比，其空間學(xué)習(xí)能力無(wú)明顯差異。但在第2-5天，Aβ1-40組大鼠的平均逃避潛伏期和平均游泳距離分別為35.7±1.8 s和832.4±55.4 cm、29.4±1.6 s和554.3±54.9 cm、23.8±1.4 s

19、和459.0±39.0 cm、23.1±1.3 s和405.1±45.7 cm；ApoE4組大鼠的平均逃避潛伏期和平均游泳距離分別為35.1±2.0 s和826.3±70.4 cm、28.6±2.1 s和557.3±53.7 cm、24.0±2.7 s和456.1±33.5 cm、23.4±1.9 s和404.6±45.8 cm。兩種AD模型的平均逃避潛伏期和平均游泳距離與對(duì)照組第2-5天的26.4±3.8 s和609.0±67.1 c

20、m、21.3±3.5 s和360.2±37.4 cm、16.1±2.8 s和267.4±32.3 cm、14.8±2.5 s和260.3±34.2 cm相比，均明顯延長(zhǎng)（P<0.05）。在空間探索實(shí)驗(yàn)中，Aβ1-40組和ApoE4組大鼠在目標(biāo)象限游泳的時(shí)間和距離占總游泳時(shí)間和距離的百分比分別為34.6±1.9％和34.1±2.4%、34.4±1.6%和34.0±2.2%，均明顯低于對(duì)照組的46.3±3.8%和46.1±3.5%（P<0.

21、01）。同時(shí)，在定位航行和空間探索實(shí)驗(yàn)中，兩種AD模型的空間學(xué)習(xí)記憶能力損傷均無(wú)明顯差異。（2）側(cè)腦室聯(lián)合注射Aβ1-40和apoE4明顯損傷大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力，且其作用強(qiáng)于單獨(dú)給予Aβ1-40或apoE4。在定位航行實(shí)驗(yàn)第1天，聯(lián)合給藥組與對(duì)照組以及單獨(dú)給予Aβ1-40或apoE4組相比，均無(wú)明顯差異。第2天，聯(lián)合給藥組大鼠搜索水下平臺(tái)的平均逃避潛伏期和游泳距離分別為41.1±2.5 s和905.4±80.8 cm，與對(duì)照組相比明

22、顯延長(zhǎng)（P<0.05），但與單獨(dú)給予Aβ1-40或apoE4組相比無(wú)明顯差異。在第3-5天，聯(lián)合給藥組大鼠的空間學(xué)習(xí)能力與單獨(dú)注射Aβ1-40或apoE4組相比也有明顯損傷，其搜索水下平臺(tái)的平均逃避潛伏期和游泳距離分別為36.0±1.1 s和782.1±71.7 cm、30.7±1.8 s和621.7±39.3 cm、29.8±1.7 s和588.8±34.1 cm。在空間探索實(shí)驗(yàn)中，聯(lián)合給藥組大鼠在目標(biāo)象限游泳的時(shí)間和距離占總游泳時(shí)間

23、和距離的百分比為27.3±1.8%和26.7±1.3%，不僅明顯低于對(duì)照組（P<0.01），也明顯低于單獨(dú)給予Aβ1-40或apoE4組（P<0.01）。（3）所有藥物均未影響大鼠的視力和運(yùn)動(dòng)能力。在連續(xù)5天的空間學(xué)習(xí)訓(xùn)練過(guò)程中，各組大鼠的平均游泳速度和尋找可視平臺(tái)的逃避潛伏期均無(wú)明顯差異。對(duì)照組、Aβ1-40組、ApoE4組和聯(lián)合給藥組的平均游泳速度分別為19.2±1.6 cm/s、19.2±1.7 cm/s、19.4±1.9 cm/

24、s和119.2±1.8 cm/s；到達(dá)可視平臺(tái)的平均時(shí)間分別為12.6±0.9 s、112.3±0.8 s、12.7±0.8 s和12.3±0.9 s。
　　Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)大鼠海馬的在體場(chǎng)電位進(jìn)行記錄，結(jié)果表明：（1）側(cè)腦室單獨(dú)注射Aβ1-40或apoE4均明顯損傷海馬CA1區(qū)LTP，但二者對(duì)LTP的壓抑作用無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在給予高頻刺激（high frequency stimulation, HFS）前，各組的基

25、礎(chǔ)fEPSPs幅度始終較穩(wěn)定，基礎(chǔ)突觸傳遞未被影響。當(dāng)給予HFS后，對(duì)照組fEPSPs的幅值立即明顯上升到177.8±4.9%，并在HFS后60分鐘仍保持在149.3±4.1%。在Aβ1-40組，給予HFS后0分鐘、30分鐘和60分鐘，fEPSPs的幅值分別為147.9±5.8%、123.4±4.1%和117.7±3.8%，與對(duì)照組相比，均顯示出明顯的壓抑（P<0.01）；在ApoE4組，給予HFS后0分鐘、30分鐘和60分鐘，fEPS

26、Ps的幅值分別為144.4±6.1%、122.8±4.4%和122.4±3.3%，與對(duì)照組相比同樣被明顯壓抑（P<0.01）；但在HFS后不同時(shí)間點(diǎn)，兩種AD模型對(duì)LTP的壓抑程度無(wú)顯著差異。（2）側(cè)腦室聯(lián)合注射Aβ1-40和apoE4明顯損傷海馬LTP，且其作用強(qiáng)于單獨(dú)注射Aβ1-40或apoE4。聯(lián)合給藥并未損傷基礎(chǔ)突觸傳遞，但在給予HFS后0分鐘、30分鐘和60分鐘，fEPSPs幅值分別為146.5±4.1%、113.6±3.2%

27、和105.0±3.8%，在各時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組相比均有明顯壓抑（P<0.01）。同時(shí)，在HFS后0分鐘和30分鐘，聯(lián)合給藥組大鼠fEPSPs的幅值與Aβ1-40組或ApoE4組相比無(wú)明顯差異；但在HFS后60分鐘，聯(lián)合給藥組LTP的壓抑程度明顯大于單獨(dú)應(yīng)用Aβ1-40（P<0.05）或apoE4（P<0.01）組。（3）三種AD模型海馬雙脈沖易化均未受到影響。在對(duì)照組、Aβ1-40組、ApoE4組及聯(lián)合給藥組，海馬CA1區(qū)的PPF值分別為1

28、94.5±6.1%、196.8±7.5%、193.1±6.8%和194.9±5.4%，各組的PPF值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。
　　第三次磁共振檢查結(jié)束后，進(jìn)行HE染色、免疫組織化學(xué)和western blot檢測(cè)，結(jié)果表明：（1）三種AD模型大鼠均出現(xiàn)明顯海馬和皮層病理改變，但程度不同。在對(duì)照組，海馬 CA1區(qū)多層神經(jīng)元整齊排列，神經(jīng)元邊界清楚，細(xì)胞核形態(tài)正常。在ApoE4組，僅出現(xiàn)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元排列輕度紊亂，部分細(xì)胞間隙

29、略增大。在Aβ1-40組和聯(lián)合給藥組，均可見(jiàn)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元排列紊亂，神經(jīng)元數(shù)目和層數(shù)明顯減少，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則、大小不一，細(xì)胞間隙明顯增大，但在聯(lián)合給藥組大鼠的海馬病變更為明顯。同時(shí)，在三種AD模型大鼠的皮層均有淋巴細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞增多，以聯(lián)合給藥組病變更為明顯；Aβ1-40組和聯(lián)合給藥組還可見(jiàn)有軟化灶出現(xiàn)，（2）三種 AD模型海馬和皮層出現(xiàn)不同程度的Aβ免疫陽(yáng)性細(xì)胞。對(duì)照組未見(jiàn)明確Aβ陽(yáng)性細(xì)胞；ApoE4組可見(jiàn)散在陽(yáng)性細(xì)胞；Aβ1-

30、40組及聯(lián)合給藥組可見(jiàn)大量的陽(yáng)性細(xì)胞，但聯(lián)合給藥組的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)最多。（3）不同 AD大鼠模型表現(xiàn)出不同程度的 pTau（S396）增加。Aβ1-40組和 ApoE4組 pTau(S396)/Tau的值分別為0.969±0.038和1.048±0.041，與對(duì)照組的0.606±0.047相比均明顯升高（P<0.01），但兩種AD模型組之間無(wú)明顯差異（P>0.05）。在聯(lián)合給藥組大鼠，pTau(S396)/Tau值為1.275±0.051，

31、不僅明顯高于對(duì)照組（P<0.01），而且也明顯高于單獨(dú)給予Aβ1-40或apoE4組（P<0.01）。
　　結(jié)論：
　?。?）在給藥后2周，三種AD大鼠模型組與對(duì)照組海馬T2值無(wú)明顯差異，提示T2值不是診斷早期AD的可靠方法。在給藥后4周，三種AD大鼠模型海馬T2值均增高，但聯(lián)合給藥組T2值增高更加明顯，推斷T2值增高可能提示AD的存在，而且與AD的嚴(yán)重程度相關(guān)。（2）在給藥后不同時(shí)間點(diǎn)，三種AD大鼠模型與對(duì)照組海馬NAA/

32、Cr+Cr1相比均存在顯著性差異，提示NAA濃度在AD早期就發(fā)生變化，且與AD的嚴(yán)重程度相關(guān)。（3）三種AD模型均可明顯損傷大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力，但損傷程度有差異，聯(lián)合給藥組的損傷較單獨(dú)給予Aβ1-40或apoE4組更為嚴(yán)重。結(jié)合1H-MRS，NAA/Cr+Cr1在AD早期就發(fā)生變化，且不同AD模型NAA濃度減低程度不同，提示NAA/Cr+Cr1減低可能比行為學(xué)實(shí)驗(yàn)更敏感。（4）三種AD模型的LTP均受到明顯壓抑，但以聯(lián)合給藥組LTP

33、的損傷更為嚴(yán)重。結(jié)合1H-MRS，NAA/Cr+Cr1在給藥后2周就發(fā)生變化，給藥后4周持續(xù)性減低，且三種AD大鼠模型之間NAA濃度減低程度不同，提示NAA/Cr+Cr1對(duì)于AD診斷具有較高的敏感性。（5）三種AD模型組均出現(xiàn)包括Aβ沉積和tau蛋白磷酸化在內(nèi)的典型AD樣病理改變，但以聯(lián)合給藥組病理改變較單獨(dú)給予Aβ1-40或apoE4組更為嚴(yán)重。三種AD模型所出現(xiàn)的病理改變嚴(yán)重程度與在磁共振檢查、行為學(xué)和電生理實(shí)驗(yàn)中所觀察到的指標(biāo)改變