泡桐叢枝病植原體延伸因子tuf基因分析及其他寄主植物的檢測(cè).pdf

1、論文包括泡桐叢枝病植原體南陽(yáng)分離物(PaWB)延伸因子(EF-TU)基因tuf的研究、泡桐叢枝病田間寄主的檢測(cè)和鑒定及其他兩種植物病害的植原體檢測(cè)三方面研究?jī)?nèi)容。 根據(jù)GenBank中已登錄的植原體延伸因子tuf基因的保守核苷酸序列設(shè)計(jì)特異引物,擴(kuò)增得到泡桐叢枝病植原體(PaWB)南陽(yáng)分離物的tuf基因,核苷酸長(zhǎng)度1185bp,編碼394個(gè)氨基酸的完整蛋白序列,大小約為43 kDa。利用蛋白分析軟件TMHMM 2.0和PROST

2、 II預(yù)測(cè)此植原體tuf為非跨膜蛋白且定位于植原體細(xì)胞質(zhì)中。將PaWB tuf基因連接到pGEX-4T-3表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)表達(dá)出分子量約62 kDa含有GST標(biāo)簽的融合蛋白。用該融合蛋白免疫德國(guó)大白兔獲得了特異性較高的抗血清。用不同的方法對(duì)泡桐叢枝病株制備的抗原進(jìn)行ELISA和Dot blotting的結(jié)果進(jìn)一步顯示了tuf蛋白具有與膜結(jié)合的特性,對(duì)提取抗原的凍融處理是獲得理想ELISA結(jié)果的重要前提條件。Wes

3、tern blot和間接免疫熒光分析表明,該抗血清分別與PaWB、PeV和CWB植原體抗原產(chǎn)生特異免疫反應(yīng),而與相應(yīng)的健康植株對(duì)照及JWB、BWB植原體抗原無(wú)免疫反應(yīng)。 用分子生物學(xué)的方法對(duì)泡桐叢枝病原的其他寄主進(jìn)行了檢測(cè)和鑒定。依據(jù)植原體16S rRNA基因設(shè)計(jì)的通用引物,采用巢式PCR檢測(cè)了從泡桐叢枝病樹(shù)附近采集的不同植物上的30份樣品。從其中8種植物中擴(kuò)增到長(zhǎng)為1246bp的片段,序列分析表明它們都屬于16SrI-D亞組,

4、與泡桐叢枝病植原體的同源性最高,初步推斷這8種植物是泡桐叢枝病的其他寄主。其中牛筋草(Eleusine indica)、狗尾草(Setaria viridis)、山藥(Dioscoreaopppsita)、燈籠泡(Physalis angulata)、南瓜(Cucurbita moschata)、楸樹(shù)(Catalpa bungei)6種植物是首次報(bào)到植原體病害；并且從辣椒(Capsicum annuum)和花生(Arachis hypo

5、gaea)中檢測(cè)到的植原體與以往文獻(xiàn)報(bào)道的辣椒僵頂病及花生從枝病病原植原體不同。本研究還在楸樹(shù)葉片黃化(CbY)樣品中擴(kuò)增到了植原體的tuf基因,其序列同源性也與泡桐叢枝病植原體最高。DAPI熒光顯微鏡和間接免疫熒光顯微鏡觀察結(jié)果表明,楸樹(shù)黃化植原體與PaWB-NY tuf抗血清產(chǎn)生特異免疫反應(yīng),并且楸樹(shù)黃葉組織中的植原體含量明顯低于泡桐叢枝病組織。 從河北承德采集表現(xiàn)異常的丁香黃葉和北京采集到的黃金槐短枝樣品中,通過(guò)巢式PCR

6、擴(kuò)增到了植原體16S rRNA基因,克隆測(cè)序,得到了長(zhǎng)度為1246bp的核苷酸序列,初步證明了采集樣品中含有植原體。序列分析和RFLP分析顯示黃金槐短枝(SclS)植原體屬于16SrⅠ-D亞組。丁香黃化(SoY)植株上植原體與豬屎豆叢枝植原體同源性最高,屬于16SrⅡ-A亞組,與報(bào)道的引起紫丁香叢枝病的病原不同。在丁香簇葉樣品(SoP)中檢測(cè)到兩種植原體,分別屬于16SrⅠ-D亞組和16SrⅡ-A亞組,推斷可能是這兩種植原體的復(fù)合侵染。