地黃免疫調(diào)節(jié)作用實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、　　近年來(lái),中草藥對(duì)機(jī)體免疫功能的調(diào)節(jié)作用越來(lái)越受到人們的關(guān)注,研究表明這種調(diào)節(jié)作用既有增強(qiáng)作用也有抑制作用,有些則有雙向調(diào)節(jié)作用。通過(guò)研究這些中草藥對(duì)機(jī)體免疫功能的調(diào)節(jié)作用,可能開(kāi)發(fā)出具有臨床應(yīng)用價(jià)值的免疫調(diào)節(jié)劑。
　　地黃為玄參科(Scrophulariaceae)植物地黃 (Rehmannia glutinosa L.)的新鮮或干燥塊根,是常用的一種傳統(tǒng)補(bǔ)益類(lèi)中藥。生地黃為地黃的干燥塊根,具有清熱涼血,養(yǎng)陰生津之功效[1]

2、。熟地黃為生地黃的加工炮制品,具有滋陰補(bǔ)血、益精填髓之功效。
　　近年來(lái),國(guó)內(nèi)外對(duì)地黃的化學(xué)成分、提取工藝、藥理作用等進(jìn)行了大量研究,研究發(fā)現(xiàn)地黃可以增強(qiáng)機(jī)體免疫功能。而古代文獻(xiàn)記載以及現(xiàn)代臨床上生地黃常被用于治療風(fēng)濕及類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)等自身免疫性疾病。提示地黃既有免疫增強(qiáng)作用,又有免疫抑制作用,但是地黃發(fā)揮免疫增強(qiáng)和免疫抑制作用的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制尚不明確。
　　因此,本實(shí)驗(yàn)室采用95%乙醇回流藥渣水提法,分別得到

3、生地黃和熟地黃的95%乙醇提取物、藥渣水提物、粗多糖和藥渣水提物去多糖部位。研究地黃發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的有效部位,并初步探討其免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)制,為地黃在臨床上的應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　上篇 生地黃提取物免疫調(diào)節(jié)作用實(shí)驗(yàn)研究
　　目的：初步探討生地黃發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制。
　　方法：體外實(shí)驗(yàn)中,常規(guī)分離Balb/c小鼠胸腺及脾的淋巴細(xì)胞,通過(guò)MTT法檢測(cè)小鼠胸腺、脾淋巴細(xì)胞增殖,酶聯(lián)免疫吸附法 (EL

4、ISA法) 檢測(cè)小鼠胸腺、脾淋巴細(xì)胞上清液Th1細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ和Th2細(xì)胞因子IL-4、IL-5的水平。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中, Balb/c小鼠灌胃給藥一周后,通過(guò)ELISA法檢測(cè)血清中IFN-γ和IL-4的水平,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠胸腺、脾的 CD3+、CD19+、CD4+ 、CD8+ 、IFN-γ+ 、IL-4+細(xì)胞比例。
　　結(jié)果：體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,生地黃95%乙醇提取物(0.01、0.1、1 mg·mL-1)和藥渣

5、水提物去多糖部位(0.03、0.3、3 mg·mL-1)均可顯著促進(jìn)Con A刺激前后小鼠胸腺淋巴細(xì)胞增殖,提高上清液IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-5的水平；抑制脾淋巴細(xì)胞增殖,降低上清液IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-5的水平,有劑量依賴性趨勢(shì)。生地黃藥渣水提部位(0.06、0.6、6 mg·mL-1)及其粗多糖部位(0.027、0.27、2.7 mg·mL-1)均可顯著促進(jìn)Con A刺激前后小鼠胸腺、脾淋巴細(xì)胞增殖,提

6、高上清液IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-5的水平,有劑量依賴性趨勢(shì)。其中生地黃粗多糖免疫增強(qiáng)作用強(qiáng)于藥渣水提部位,95%乙醇提取物免疫抑制作用強(qiáng)于藥渣水提物去多糖部位。
　　體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,小鼠灌胃給予生地黃不同提取物(原生藥量 5、10、20 g·kg-1 ·day-1)一周后,95%乙醇提取物和藥渣水提物去多糖部位均可顯著降低血清IFN-γ的水平,提高血清IL-4的水平；生地黃藥渣水提物和粗多糖組均可顯著提高血清IF

7、N-γ、IL-4的水平。
　　流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠胸腺淋巴細(xì)胞及其亞群分布結(jié)果顯示,生地黃不同提取物均可顯著提高小鼠胸腺CD3+細(xì)胞比例,CD4+和CD8+細(xì)胞、IFN-γ+和IL-4+細(xì)胞比例,但是并不改變其比值。
　　流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠脾淋巴細(xì)胞及其亞群分布結(jié)果顯示,生地黃 95%乙醇提取物和藥渣水提物去多糖部位可降低小鼠脾CD3+細(xì)胞比例、提高CD19+細(xì)胞比例；可降低CD4+和CD8+細(xì)胞比例,但是并不改變其比值；

8、可降低IFN-γ+細(xì)胞比例、提高IL-4+細(xì)胞比例。生地黃粗多糖可提高小鼠脾 CD3+細(xì)胞比例、降低 CD19+細(xì)胞比例；可提高CD4+細(xì)胞比例；可提高IFN-γ+和IL-4+細(xì)胞比例,但是并不改變其比值。
　　結(jié)論：生地黃提取物具有免疫調(diào)節(jié)作用,其中發(fā)揮免疫抑制作用的有效部位為生地黃 95%乙醇提取物和藥渣水提物去多糖部位,根據(jù)目前實(shí)驗(yàn)室成分研究結(jié)果提示,有效成分可能為環(huán)烯醚萜苷類(lèi)成分；發(fā)揮免疫增強(qiáng)作用的有效成分為粗多糖成分。

9、免疫抑制作用機(jī)理可能通過(guò)降低外周T淋巴細(xì)胞及其亞群比例,降低Th1/Th2細(xì)胞比值,進(jìn)而調(diào)節(jié)Th1和Th2細(xì)胞因子的表達(dá)；免疫增強(qiáng)作用機(jī)理可能通過(guò)提高外周T淋巴細(xì)胞及其亞群比例,但是并不改變淋巴細(xì)胞亞群比值,進(jìn)而調(diào)節(jié)Th1和Th2細(xì)胞因子的表達(dá)。
　　生地黃提取物對(duì)胸腺淋巴細(xì)胞均具有一定的促進(jìn)作用,有利于胸腺中T細(xì)胞分化、發(fā)育和成熟,作用機(jī)制可能通過(guò)提高胸腺中T淋巴細(xì)胞及其亞群比例,進(jìn)而調(diào)節(jié)Th1、Th2細(xì)胞因子的表達(dá)。

10、>　　下篇 熟地黃提取物體外免疫調(diào)節(jié)作用實(shí)驗(yàn)研究
　　目的：初步探討熟地黃發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的有效部位及其免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)制。
　　方法：常規(guī)分離Balb/c小鼠胸腺及脾的淋巴細(xì)胞,通過(guò)MTT法檢測(cè)小鼠胸腺、脾淋巴細(xì)胞增殖,ELISA法檢測(cè)小鼠胸腺、脾淋巴細(xì)胞上清液Th1細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ和Th2細(xì)胞因子IL-4、IL-5的水平。
　　結(jié)果：體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,熟地黃95%乙醇提取物(0.015、0.15、1

11、.5 mg·mL-1)和藥渣水提物去多糖部位(0.014、0.14、1.4 mg·mL-1)可顯著促進(jìn)Con A刺激前后小鼠胸腺淋巴細(xì)胞增殖,提高上清液IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-5的水平；抑制脾淋巴細(xì)胞增殖,降低上清液IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-5的水平。熟地黃藥渣水提物 (0.049、0.49、4.9 mg·mL-1)和粗多糖 (0.032、0.32、3.2 mg·mL-1) 均可顯著促進(jìn)Con A刺激前后小鼠胸

12、腺及脾的淋巴細(xì)胞的增殖,提高上清液IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-5水平,有劑量依賴性趨勢(shì)。其中熟地黃粗多糖組增強(qiáng)作用強(qiáng)于藥渣水提部位,熟地黃 95%乙醇提取物免疫抑制作用強(qiáng)于藥渣水提物去多糖部位。
　　結(jié)論：熟地黃提取物具有免疫調(diào)節(jié)作用,其中發(fā)揮免疫抑制作用的有效部位為熟地黃 95%乙醇提取物和藥渣水提物去多糖組,發(fā)揮免疫增強(qiáng)作用的有效部位為熟地黃藥渣水提物中的粗多糖成分。免疫調(diào)節(jié)機(jī)理與其調(diào)節(jié)外周T淋巴細(xì)胞Th1和Th2