骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞干預(yù)大鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：⑴采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法，體外培養(yǎng)與純化Wistar大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并對其成脂特性進(jìn)行鑒定。⑵探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對單側(cè)輸尿管結(jié)扎模型大鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響。⑶采用Brdu體外標(biāo)記骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，再將標(biāo)記的細(xì)胞移植到UUO模型動物體內(nèi)，觀察bMSCs經(jīng)過靜脈途徑移植后在腎臟的分布情況。 方法：①6周齡清潔級雄性Wistar大鼠，處死后浸泡于75％酒精中15min，頭部露出。無菌條件下取兩側(cè)股骨和脛骨，去除骨

2、表面附著的組織，用含10 萬U/L的青霉素和100ug/L的鏈霉素的0.01M的PBS 沖洗3-5 次，在無菌條件下，鉗掉骨端，將骨鉗成碎骨片，浸于PBS中15min，最后經(jīng)單細(xì)胞濾網(wǎng)濾過，1500轉(zhuǎn)，離心5min，棄上清，用含10％胎牛血清、10 萬U/L的青霉素和100ug/L的鏈霉素的L-DMEM培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞，繼而按4×105細(xì)胞/ml的細(xì)胞密度接種到直徑10cm的培養(yǎng)皿中，置37℃、體積分?jǐn)?shù)5％CO 2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48小

3、時(shí)后首次換液，去除漂浮的血細(xì)胞，以后每3天更換培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到70％-80％融合時(shí)，用0.25％胰酶消化傳代?？刂埔让傅牧考跋瘯r(shí)間，可以有效去除混雜細(xì)胞。取第三代bMSCs，置于成脂細(xì)胞誘導(dǎo)液中培養(yǎng)21天后，行油紅O染色鑒定。②54只Wistar大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)對照組(n=18)、bMSC注射組（bMSC組，n=18）和生理鹽水注射組。bMSC組和PS組大鼠于UUO模型建立的同時(shí)經(jīng)下腔靜脈分別注入bMSCs和等體積生理鹽水。于建模

4、后第3、7和14天分批處死大鼠并采集血液及腎臟組織標(biāo)本，Real-time PCR技術(shù)檢測腎小管細(xì)胞FasL、Bax mRNA表達(dá)，免疫組化染色檢測FasL蛋白表達(dá)及分布；TUNEL法檢測腎小管細(xì)胞凋亡，計(jì)算凋亡指數(shù)。③待細(xì)胞達(dá)培養(yǎng)皿底50％融合時(shí)，加入Brdu貯存液，調(diào)整終濃度為10μmol/L，混勻后繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)?？瞻讓φ战M不加Brdu，免疫熒光觀測。建立UUO模型，同時(shí)經(jīng)下腔靜脈注入1ml已制備好的Brdu標(biāo)記的bMSCs懸液

5、；對照組（n=6）為生理鹽水注射組，結(jié)扎輸尿管的同時(shí)經(jīng)下腔靜脈注入1ml生理鹽水。于建模后第3、7和14天分批處死大鼠并采集腎臟組織標(biāo)本，免疫組化染色檢測Brdu陽性細(xì)胞表達(dá)及分布。 結(jié)果：⑴bMSCs以分散的克隆集落方式生長，細(xì)胞為長梭形，高倍鏡下可見細(xì)胞核橢圓形，有2～3個(gè)清晰的核仁。經(jīng)成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)7d后，細(xì)胞胞漿開始出現(xiàn)脂滴。誘導(dǎo)培養(yǎng)21d,油紅O染色后顯示細(xì)胞胞漿內(nèi)顆粒狀紅色脂滴形成。⑵與假手術(shù)組比較，bMSC組和PS組

6、建模后各時(shí)間點(diǎn)FasL、BaxmRNA及FasL蛋白表達(dá)均明顯上調(diào)，腎小管細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著增加。建模后第3、7天時(shí)，bMSC組FasL、Bax mRNA和FasL蛋白表達(dá)的上調(diào)幅度及腎小管細(xì)胞凋亡指數(shù)的增加程度均明顯低于PS組；至建模后第14天時(shí)，bMSC組與PS組各項(xiàng)檢測指標(biāo)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。⑶體外培養(yǎng)的bMSCs可被Brdu標(biāo)記，標(biāo)記率>95％。標(biāo)記細(xì)胞移植入模型動物體內(nèi)后，腎臟組織內(nèi)未見到Brdu陽性細(xì)胞。 結(jié)論：①