衰老的臍帶間充質(zhì)干細胞生物學特性及基因表達譜的研究.pdf

1、目的:
　　 1.觀察并檢測人臍帶間充質(zhì)干細胞體外培養(yǎng)衰老過程中細胞形態(tài)學、表型、生長動力學及誘導分化能力等生物學特性的改變;
　　 2.檢測人臍帶間充質(zhì)干細胞體外培養(yǎng)衰老過程中基因表達譜的改變并探討其可能的機制。
　　 方法
　　 1.細胞培養(yǎng):用組織塊貼壁法培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細胞，取第3代細胞作為對照組，連續(xù)培養(yǎng)到第15代的細胞為衰老組，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，并分別制成細胞爬片掃描電鏡觀察并拍照。

2、
　　 2.生長增殖:分別取對照組和衰老組細胞，接種于96孔培養(yǎng)板中，各設(shè)8復孔，培養(yǎng)6天。每日檢測在450nm波長處測吸光值(OD值)，繪制細胞生長曲線。
　　 3.表型檢測:對照組和衰老組細胞消化后充分吹打成單細胞懸液，使用流式細胞儀檢測并分析兩組細胞CD34、CD45、CD44和CD105等表型變化。
　　 4.誘導分化能力鑒定:將對照組和衰老組細胞置于不同的誘導培養(yǎng)液中向成骨細胞及成脂細胞誘導分化，誘導分

3、化14天后，進行固定，并分別進行相應的染色觀察誘導分化差異。
　　 5.基因表達譜分析:細胞洗滌后加入Trizol試劑，提取總RNA，進行基因表達譜芯片雜交、檢測和數(shù)據(jù)分析，并用DNA芯片掃描儀行微陣列掃描。將掃描結(jié)果進行標準化分析，與對照組相比|log2Ratio|＞2(4-foldchange)為差異表達，并進行GO及KEGGpathway分析。
　　 6.PCR驗證:根據(jù)基因表達譜的結(jié)果，選取了多個典型的差異基因進

4、行實時定量PCR驗證。檢測對照組和衰老組細胞BAX，F(xiàn)ADD，JAK2，IGF3BP5，PDK1，Col-Ⅲ，Col-Ⅳ，SMAD2，SAMD4，BMPR2，CCND2等基因的差異表達。
　　 結(jié)果
　　 1.細胞形態(tài):對照組細胞呈典型的成纖維狀，每平方毫米可達500個細胞;衰老組細胞個體差異較大，細胞變得寬大，每平方毫米僅有約150個細胞，衰老細胞核質(zhì)比減小。掃描電鏡下可見年輕組細胞形態(tài)飽滿，表面微絨毛分布均勻，而衰老

5、組細胞偽足增多，整體扁平。
　　 2.增殖情況:對照組和衰老組生長曲線在接種后都有一個停滯期（12-24小時），然后進入增殖期，對照組細胞能更快的進入增殖期，并在第5天達到更高的細胞數(shù)量后進入平臺期。而衰老組停滯期長，進入增殖期后第3天進入平臺期，最終的細胞數(shù)量也少。
　　 3.表型檢測:根據(jù)流式細胞儀檢測結(jié)果，對照組和衰老組細胞CD34和CD45均為陰性表達，CD44和CD105均為高表達，組間陽性率表達并無顯著差異。

6、
　　 4.分化能力:在適當?shù)姆只瘲l件誘導下，對照組和衰老組細胞均能向成骨和脂肪細胞分化:向成骨細胞誘導14天后大部分細胞出現(xiàn)鈣化胞外基質(zhì)，茜素紅S染色陽性堿性磷酸酶染色陽性;向脂肪細胞誘導分化14天后約50％的細胞內(nèi)出現(xiàn)油紅O陽性脂肪顆粒。這些結(jié)果證明所獲得的貼壁細胞符合間充質(zhì)干細胞的特征，與對照組細胞相比，衰老組細胞誘導分化能力顯著降低。
　　 5.差異基因信號通路及基因聚類分析:將衰老組細胞與對照組差異表達的基因進

7、行KEGGpathway分析(p＜0.05)，可見衰老組顯著上調(diào)通路有20條，其中包括自身免疫病、退行性疾病相關(guān)通路，下調(diào)通路49條，涉及通路包括合成代謝、細胞外基質(zhì)、物質(zhì)代謝和細胞增殖等。對41000+條基因進行檢測，差異基因多達8000個，對顯著差異的2000個基因進行聚類分析，顯示差異基因涉及轉(zhuǎn)錄、翻譯、生物合成、物質(zhì)代謝、信號轉(zhuǎn)導、細胞增殖、細胞遷移、細胞間連接等多方面。
　　 6.PCR驗證:熒光定量PCR示衰老組細胞

8、與對照組細胞相比，BAX，F(xiàn)ADD，JAK2，IGF3BP5，PDK1和MGMT等基因在衰老細胞中表達上調(diào)，而Col-Ⅲ，Col-Ⅳ，SMAD2，SAMD4，BMPR2，CCND2和PAK2等基因表達下調(diào)。
　　 結(jié)論
　　 1.第3代對照組細胞及第15代衰老組細胞具有增殖潛能、相同的細胞表型，并能向成骨、脂肪細胞誘導分化，但衰老組細胞在形態(tài)學、增殖速度和誘導分化的能力均較對照組降低。
　　 2.體外培養(yǎng)人臍帶間