山東部分地區(qū)病毒性腦炎的病原學(xué)分析.pdf

1、目的: 1.病原學(xué)分離 建立微量高通量、多細(xì)胞譜病毒分離模型，對(duì)腦炎患者的腦脊液標(biāo)本進(jìn)行分離培養(yǎng)，獲得病毒株，為病毒鑒定和分子流行病學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。 2．病毒鑒定 用分子生物學(xué)方法對(duì)所分離病毒進(jìn)行鑒定分型。 3．系統(tǒng)進(jìn)化分析 應(yīng)用生物信息學(xué)方法繪制病毒的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，了解病毒的地理區(qū)域性、病毒進(jìn)化特征和親緣關(guān)系，探索是否有新的基因型或血清型甚至新的病毒株的流行，為防治病毒性腦炎提供理論依據(jù)。

2、 方法: 1．標(biāo)本采集 收集山東地區(qū)病毒性腦炎患者的腦脊液或糞便標(biāo)本，患者年齡在0-15歲，臨床診斷排除乙型腦炎。-20℃保存?zhèn)溆谩?2．病毒分離 將8株不同的細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每種細(xì)胞接種一行，細(xì)胞長(zhǎng)成單層后孔內(nèi)接種腦脊液標(biāo)本，每孔5-10μL，每份標(biāo)本縱向接種8孔（8種細(xì)胞系），35℃、5％CO2培養(yǎng)。出現(xiàn)細(xì)胞病變（cytopathic effect，CPE）者傳代培養(yǎng)兩次。兩次均

3、出現(xiàn)CPE者視為細(xì)胞培養(yǎng)陽(yáng)性，-70℃保存用于病毒鑒定。 3．病毒鑒定 將培養(yǎng)物首先用腸道病毒通用引物做逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）并測(cè)序，進(jìn)行初步篩查。對(duì)確定為腸道病毒的分離株用VP1區(qū)特異引物擴(kuò)增，確定型別；排除腸道病毒的分離株用隨機(jī)引物進(jìn)行鑒定。 4．系統(tǒng)進(jìn)化分析 將所測(cè)得的序列與GeneBank中的已有序列進(jìn)行在線比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析，明確病毒的科、屬、型，對(duì)其可能來(lái)源進(jìn)行推測(cè)；將相同疫源、

4、相同分離時(shí)間的病毒株進(jìn)行核苷酸多序列比對(duì)，并分析其氨基酸序列的變化，探討其變異趨勢(shì)。 結(jié)果: 1．103份標(biāo)本中分離到62株病毒 93份腦脊液標(biāo)本中有56份得到病毒培養(yǎng)物、10份糞便標(biāo)本中有6份得到病毒培養(yǎng)物，總病毒分離率為60．19（62/103）。分離株均能致明顯的CPE。 2．8株腸道病毒得到鑒定，其中4株為EV71 2．1 從獲得培養(yǎng)的62株病毒中提取RNA，用腸道病毒通用引物擴(kuò)增，有15

5、份電泳后得到目的條帶，其中8份經(jīng)序列測(cè)定確定為腸道病毒。 2．2 其中4份用VP1引物P4S/P4A得到擴(kuò)增，測(cè)序鑒定為71型腸道病毒（EV71）。 2．3 排除腸道病毒的11份分離株用隨機(jī)引物擴(kuò)增得到彗尾狀條帶，回收擴(kuò)增產(chǎn)物、連接T載體轉(zhuǎn)化DH-5a，選取10個(gè)克隆測(cè)序獲得3株丙型肝炎病毒同源序列，余未獲相關(guān)病毒序列；陽(yáng)性克隆菌株作為片段庫(kù)存，待做進(jìn)一步分析。 3．系統(tǒng)進(jìn)化分析表明所分離EV71為C4亞型

6、 3．1 對(duì)所測(cè)得的序列進(jìn)行與基因庫(kù)序列在線比對(duì)、多序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析，8份經(jīng)EV通用引物鑒定為腸道病毒，分別與COX-B5、EV71型的5’非編碼區(qū)同源性最高，其中4株病毒用VP1區(qū)特異引物P4S/P4A得到擴(kuò)增者經(jīng)序列比對(duì)鑒定為EV71，序列已提交到GeneBank，序列號(hào)依次為FJ594472～FJ594475。 3．2 在線Blast比對(duì)發(fā)現(xiàn)在2697-3266核苷酸區(qū)域，本課題所得序列與2008年北京分離株（G

7、enebank序列號(hào)FJ606448．1）、安徽阜陽(yáng)株（Genebank序列號(hào)EU697901．1）序列一致率均達(dá)到98％以上；分別有1～8個(gè)堿基不同程度的變異，均未發(fā)現(xiàn)堿基缺失。 3．3 氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)FJ594473株第155位氨基酸由呈堿性的賴氨酸變?yōu)槌仕嵝缘墓劝彼幔↘→E）；FJ594474株的第136位氨基酸由丙氨酸變?yōu)樘K氨酸（A→T）；FJ594472株的第88位氨基酸則由蘇氨酸變?yōu)楸彼帷?62位氨基酸由纈氨酸

8、變?yōu)楫惲涟彼幔═→A，V→I）。 3．4 應(yīng)用DNA MAN軟件繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，發(fā)現(xiàn)所分離的4株EV71與2008年北京株和安徽株序列差異在5％以內(nèi)，同屬于C4亞型。 結(jié)論: 1．所建立的微量多細(xì)胞培養(yǎng)法具有簡(jiǎn)便、快速的特點(diǎn)，適合用于大樣本量的病毒初步篩查； 2．分離到了62株病毒，其中腸道病毒8株（含4株EV71）； 3．2006～2007年山東濟(jì)南、臨沂地區(qū)有以腸道病毒為病原的腦炎流行；200