體外觀察Foxp3及IL-10在人天然CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞中的作用.pdf

1、調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(regulatory T cells,Tregs)是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要組成部分,在防止自身免疫,保持機(jī)體的自身耐受性中發(fā)揮著決定性作用。到目前為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種Tregs存在,其中CD4+Treg研究最為廣泛,包括CD4+CD25+Tregs,Tr1細(xì)胞,Th3細(xì)胞,CD4+CD103+T細(xì)胞和CD4+CD25-Tregs。CD4+CD25+Treg細(xì)胞是目前研究最多的一類調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。天然存在的CD4+CD25+Tr

2、eg(nTreg)約占CD4+細(xì)胞的5％～10％,通過細(xì)胞一細(xì)胞接觸,分泌產(chǎn)生IL-10、TGF-β1及CTLA-4等細(xì)胞因子及共刺激分子,進(jìn)而抑制T細(xì)胞、B細(xì)胞的分化及功能,是誘導(dǎo)和維持外周免疫耐受的重要細(xì)胞。該群細(xì)胞表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子FoxP3(forkhead box p3)、CD45RBlow、CD62L、CD103、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原4(CTLA-4)和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子受體(GITR)等。
　　 CD4+CD

3、25+Tregs作為一類調(diào)節(jié)性細(xì)胞,在抑制自身反應(yīng)性細(xì)胞增殖,維持免疫環(huán)境的穩(wěn)定方面起著重要作用。CD4+CD25+Treg細(xì)胞數(shù)量的減少、抑制功能的受損和(或)表面分子表達(dá)的缺陷,都可能導(dǎo)致自身免疫病的發(fā)生。在大量糖尿病的動(dòng)物模型和1型糖尿病患者的研究中均發(fā)現(xiàn)CD4+CD25+Treg細(xì)胞的缺陷。另外,腫瘤患者外周血CD4+CD25+Treg細(xì)胞數(shù)量明顯增多,并且在腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞或腫瘤相關(guān)淋巴細(xì)胞中,CD4+CD25+Treg細(xì)胞數(shù)

4、量也明顯增多。實(shí)驗(yàn)研究中也多將CD4+、CD25+、FoxP3+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞數(shù)量的變化作為免疫激活劑和抗腫瘤治療作用評(píng)價(jià)的觀察指標(biāo)之一。在同種/異種器官和/或細(xì)胞移植免疫中,CD4+CD25+Treg細(xì)胞在免疫耐受中發(fā)揮重要的作用。Cohen等實(shí)驗(yàn)證明去除移植物中CD4+CD25+T細(xì)胞加重移植物抗宿主病(GVHD),移植物中同時(shí)加入來自供鼠的新鮮分離的CD4+CD25+T細(xì)胞減輕GVHD。
　　 轉(zhuǎn)錄因子Foxp3特異地高

5、表達(dá)于CD4+CD25+Treg細(xì)胞內(nèi),是叉頭/翼狀2螺旋轉(zhuǎn)錄因子家族的一個(gè)新成員。其最初的發(fā)現(xiàn)源于對免疫缺陷病Scurfy小鼠的研究。Scurfy小鼠患有一種X-連鎖隱性遺傳病,這種疾病由異?；罨腃D4+T細(xì)胞介導(dǎo),產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子,造成對自身組織器官的損害。Brunkow于2001年在scurfy小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了Foxp3基因的突變,突變基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物scurfin缺失功能性forkhead結(jié)構(gòu)域,從而不能夠發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制因子的功

6、能。類似的突變異常也出現(xiàn)在人類免疫失調(diào)-多發(fā)性內(nèi)分泌腺病-腸病-X連鎖綜合征(Immunodysregtnation,Polyendocrinopathy,Enteropathy,X-linkedsyndrom,IPEX),從而提示Foxp3基因在免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)中的重要作用。對嚙齒類動(dòng)物的研究中,Foxp3對的關(guān)鍵作用已經(jīng)得到公認(rèn),Foxp3特異的表達(dá)于調(diào)節(jié)性T細(xì)胞,并控制著調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的發(fā)展和功能。但是在人類,Foxp3對CD4+CD2

7、5+Treg細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用尚存在許多爭議,有研究證明在CD4+CD25-Foxp3-T細(xì)胞中誘導(dǎo)Foxp3表達(dá)并不能使這些細(xì)胞具備調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的抑制功能,而且活化的非抑制性T細(xì)胞表面發(fā)現(xiàn)有Foxp3的表達(dá),這就使得人們對Foxp3在Tregs中的作用產(chǎn)生了質(zhì)疑。目前,體外擴(kuò)增Tregs已經(jīng)成為可能,進(jìn)一步擴(kuò)增的Tregs將被用于臨床治療一些自身免疫性疾病或者預(yù)防移植排斥,這樣更加要求我們明確是哪個(gè)因子調(diào)控著Treg細(xì)胞的表面標(biāo)志和抑制功

8、能。
　　 目前對CD4+CD25+T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫抑制作用的效應(yīng)機(jī)制還不明確,實(shí)驗(yàn)結(jié)果也存在著矛盾。有些實(shí)驗(yàn)支持CD4+CD25+Treg細(xì)胞是通過與細(xì)胞接觸發(fā)揮抑制作用；另一些研究表明CD4+CD25+T細(xì)胞也可通過分泌細(xì)胞因子(IL-10,TGF-β)而介導(dǎo)抑制效應(yīng)。我們以前的研究證實(shí),在異種免疫反應(yīng)中,擴(kuò)增Tregs增強(qiáng)的抑制功能伴隨著細(xì)胞因子IL-10的增加,表明了IL-10在異種免疫反應(yīng)中有重要作用,但具體的作用機(jī)制

9、仍不明確。但目前關(guān)于IL-10在Treg介導(dǎo)的抑制作用中究竟有無作用仍不明確。
　　 在本研究利用RNA干擾技術(shù)分別抑制Foxp3和IL-10基因表達(dá),觀察Foxp3和IL-10是否有助于維持體外擴(kuò)增的人天然CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的抑制性表型標(biāo)志、功能基因及Treg介導(dǎo)的對異種/同種異體刺激的效應(yīng)性T細(xì)胞的增殖反映的抑制作用。
　　 第一部分 Foxp3在人天然CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞中的作用
　　

10、 研究目的:通過抑制Foxp3基因表達(dá),觀察其對CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表型及抑制功能的影響。
　　 研究方法:1.調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的分離和體外培養(yǎng)。根據(jù)人CD4+CD25+淋巴細(xì)胞分離試劑盒分離人Tregs。并按照實(shí)驗(yàn)室成熟的擴(kuò)增方法培養(yǎng)細(xì)胞2-3周后用于下一步試驗(yàn)。2.SiRNA轉(zhuǎn)染:公司合成的Foxp3 siRNA與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染復(fù)合體轉(zhuǎn)染至擴(kuò)增的Tregs。非特異性siRNA轉(zhuǎn)染的Tregs和未傳染的Tregs作為對照組。

11、3.采用實(shí)時(shí)定量PCR(realtime-PCR)和Western blotting、免疫熒光法分別檢測Foxp3基因和蛋白的表達(dá)。實(shí)時(shí)定量PCR檢測Tregs功能相關(guān)基因表達(dá)。4.流式細(xì)胞儀觀察Tregs表型的改變。5.ELISA測定Tregs及活化的效應(yīng)性CD4+CD25-T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子水平。6.增殖抑制試驗(yàn):各組Tregs與同一個(gè)體的效應(yīng)性CD4+CD25-T細(xì)胞,及其異種(豬)或同種異體(人)的外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)

12、共培養(yǎng)5天,觀察Tregs對效應(yīng)性CD4+CD25-T細(xì)胞增殖的抑制功能變化。7.細(xì)胞毒性試驗(yàn):分離以上共培養(yǎng)體系中的效應(yīng)性CD4+CD25-T細(xì)胞,再與異種或同種異體PBMC共培養(yǎng)后,觀察目標(biāo)PBMC的調(diào)亡情況。7.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 結(jié)論:Foxp3 siRNA成功轉(zhuǎn)染到人天然CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞內(nèi),并引起了基因抑制,蛋白表達(dá)減少。Foxp3基因抑制導(dǎo)致了Tregs表型標(biāo)志表達(dá)改變,相關(guān)功能基因表達(dá)下調(diào),對抑制效應(yīng)

13、性T細(xì)胞增殖的功能下降,抑制性細(xì)胞因子分泌下降,以及對抑制效應(yīng)性T細(xì)胞產(chǎn)生的效應(yīng)性細(xì)胞因子的作用減弱。通過以上結(jié)果證實(shí)不論在異種免疫反應(yīng)還是同種免疫反應(yīng)中,Foxp3是人天然CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。
　　 第二部分 IL-10在人天然CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞中的作用
　　 研究目的:通過抑制IL-10基因表達(dá),觀察其對CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表型及抑制功能的影響。
　　 研究方法

14、:1.調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的分離和體外培養(yǎng)。2.siRNA轉(zhuǎn)染:公司合成的IL-10 siRNA與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染復(fù)合體轉(zhuǎn)染至擴(kuò)增的Tregs；非特異性siRNA轉(zhuǎn)染的Tregs和未傳染的Tregs作為對照組。3.采用實(shí)時(shí)定量PCR(realtime-PCR)和Western blotting分別檢測IL-10基因和蛋白的表達(dá)。實(shí)時(shí)定量PCR檢測Tregs功能相關(guān)基因的表達(dá)。4.流式細(xì)胞技術(shù)觀察Tregs表型的改變。5.ELISA測定Tresg及活化

15、的效應(yīng)性CD4+CD25-T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子。6.增殖抑制試驗(yàn):各組Treg與同一個(gè)體的效應(yīng)性CD4+CD25-T細(xì)胞,及其異種(豬)或同種異體(人)的單個(gè)核細(xì)胞共培養(yǎng)5天,觀察Treg對效應(yīng)性CD4+CD25-T細(xì)胞增殖的抑制功能變化。利用transwell小室非接觸式共培養(yǎng)的方法將以上細(xì)胞共培養(yǎng)后同樣觀察效應(yīng)性CD4+CD25-T細(xì)胞增殖變化。在以上共培養(yǎng)體系中加入重組人白細(xì)胞介素10(rhIL-10),觀察其對效應(yīng)性CD4+CD

16、25-T細(xì)胞增殖的作用及對減低的Treg抑制功能的逆轉(zhuǎn)作用。7.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 結(jié)論:IL-10 siRNA成功轉(zhuǎn)染到人天然CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞內(nèi),并引起了基因抑制,蛋白表達(dá)減少。IL-10基因抑制沒有影響Tregs表型標(biāo)志表達(dá),相關(guān)功能基因表達(dá),Tregs對效應(yīng)性T細(xì)胞分泌效應(yīng)因子的抑制作用以及Tregs自身分泌抑制性細(xì)胞因子TGF-β。功能實(shí)驗(yàn)表明IL-10基因抑制降低了Tregs對異種抗原刺激的效應(yīng)性CD4+