馬鈴薯抗晚疫病主效位點(diǎn)的基因定位和遺傳分析.pdf

1、馬鈴薯(Solanumtuberosum)屬茄科茄屬植物，起源于南美洲安第斯山脈一帶，是世界上僅次于水稻、小麥、玉米的第四大糧食作物，在世界糧食安全體系中具有重要作用。由致病疫霉菌(Phytophthorainfestans(Mont.)deBary.)引起的晚疫病是馬鈴薯世界范圍內(nèi)最具毀滅性的病害，每年引起數(shù)十億美元的損失，我國每年因晚疫病造成的減產(chǎn)損失在10億美元以上。因?yàn)镻.infestans存在有性和無性兩種生殖方式，具有極高的

2、進(jìn)化潛力，通過常規(guī)育種導(dǎo)入到栽培種中的抗性R基因很容易被克服?，F(xiàn)在，通過生物工程手段構(gòu)建抗病基因近等混合系成為持久防控晚疫病的最有希望的策略之一，然而這種策略需要克隆多個(gè)晚疫病抗性基因。 本研究旨在通過對(duì)馬鈴薯晚疫病主效抗性基因R10和尺R11分離群體的遺傳分析和基因定位，初步揭示馬鈴薯11號(hào)染色體抗晚疫病主效位點(diǎn)(MLB)的基因組成和遺傳特性，為進(jìn)一步的基因克隆和了解馬鈴薯野生群體的晚疫病抗性機(jī)制并最終持久地防控馬鈴薯晚疫病奠

3、定基礎(chǔ)。本研究的主要結(jié)果如下： 1.通過對(duì)R10基因分離群體的遺傳分析和作圖表明，主效基因和抗性QTLs共同決定了R10的晚疫病抗性。馬鈴薯晚疫病抗性基因R10抗譜廣，應(yīng)用價(jià)值大，常用于馬鈴薯抗病雜交育種。利用三個(gè)不同小種但含有同一個(gè)無毒基因Avr10的晚疫病菌株分別對(duì)R10分離群體進(jìn)行離體葉片接種，結(jié)果表明分離群體對(duì)這三個(gè)菌株表現(xiàn)出不同的抗病反應(yīng)。其中針對(duì)菌株IPO-0或99018的抗性是由QTLs控制的數(shù)量性狀，而針對(duì)菌株8

4、9148-9的抗性是由主效基因即R10控制的。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，針對(duì)菌株IPO-0或99018的抗性QTLs與位于馬鈴薯11號(hào)染色體末端的R10位點(diǎn)連鎖。所以，抗晚疫病主效基因R10與抗性QTLs成簇存在很可能是R10鑒別寄主良好田間抗性的原因。 2.利用比較基因組學(xué)結(jié)合BSA分析方法定位了馬鈴薯抗晚疫病土效基因R10，并構(gòu)建了R10位點(diǎn)的高分辨率遺傳圖譜。R10位點(diǎn)位于馬鈴薯11號(hào)染色體的短臂末端，與已克隆的晚疫病抗性基因R3a

5、同屬丁抗晚疫病主效位點(diǎn)的單倍型(haplotypes)。應(yīng)用比較基因組學(xué)和BSA分析，開發(fā)了6個(gè)與R10連鎖的分子標(biāo)記，并將R10初步定位在1001T和C2-At5g9960兩個(gè)遺傳距離為2.6cM分子標(biāo)記之間。R10位于已克隆的晚疫病抗性基因R3a的近端粒區(qū)。利用R10位點(diǎn)的兩側(cè)標(biāo)記，從1942株R10分離群體中篩選劍99株R10位點(diǎn)重組單株，對(duì)其進(jìn)行已開發(fā)標(biāo)記分析和接種鑒定，從而構(gòu)建了R10位點(diǎn)的高分辨率遺傳圖譜。R10基因被定位于

6、標(biāo)記656T和1001T之間的0.26cM的遺傳區(qū)間內(nèi)，為抗晚疫病分子標(biāo)記輔助育種和R10基因的最終克隆打下了基礎(chǔ)。 3.通過馬鈴薯MLB位點(diǎn)比較作圖，定位了馬鈴薯抗晚疫病主效基因R11。以晚疫病抗性基因R11的鑒別寄土MaR11和不含已知抗性基因的品種Katahdin為雜交親本的F1群體為雜交親本，對(duì)包含83個(gè)基因型的R11基因的分離群體進(jìn)行了晚疫病菌株接種和遺傳分析，確定R11為主效單基因，在MaR11以單式(simplex

7、)存在。應(yīng)用比較作圖和BSA分析，開發(fā)了6個(gè)與R11連鎖的分子標(biāo)記，并將R11定位在11號(hào)染色體末端，距離最近的C2_At5g59960標(biāo)記遺傳距離約為2.4cM。R11較晚疫病抗性基因R3a和R10更靠近近端粒區(qū)。本研究所獲得的遺傳圖譜為進(jìn)一步構(gòu)建R11分辨率遺傳圖譜提供了基礎(chǔ)。 4.建立了從馬鈴薯BAC文庫中快速富集抗病基因及其同源序列的磁珠分離系統(tǒng)。我們首先根據(jù)晚疫病抗性基因R3a家族的序列比對(duì)結(jié)果設(shè)計(jì)了R3a基因家族的保

8、守探針，并將含有R3a基因的BACSH23G23部分酶切成7-11kbDNA片段。通過結(jié)合保守探針的磁珠系統(tǒng)對(duì)上述7-11kbDNA片段進(jìn)行R3a基因分離，將磁珠富集劍的片段克隆到雙元載體pBINPLUS上。通過陽性克隆和菌落PCR鑒定表明，含有R3a基因的克隆比率達(dá)到82.76％，相對(duì)于磁珠系統(tǒng)富集前，R3a基因比率提高近19倍。傳統(tǒng)的基因克隆方式，圖位克隆和轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法，在遵循同源四倍體的四體遺傳規(guī)律的栽培馬鈴薯中應(yīng)用難度極大，而本