用人體內(nèi)源性單體構(gòu)建的聚陽離子基因載體的研究.pdf

1、作為基因藥物的輸送材料，聚陽離子（polycation）非病毒載體和病毒及脂質(zhì)體載體相比具有無傳染性、基因擔(dān)載密度和擔(dān)載量大、化學(xué)結(jié)構(gòu)可控制、性質(zhì)穩(wěn)定以及可大量制備等優(yōu)點(diǎn)而越來越受到研究者的重視，但聚陽離子需要克服轉(zhuǎn)染活性低，化學(xué)毒性大的問題。我們認(rèn)為聚陽離子載體從實(shí)驗(yàn)試劑走向臨床藥物的關(guān)鍵在于材料的化學(xué)設(shè)計(jì)必須兼顧從基因復(fù)合、體內(nèi)循環(huán)、細(xì)胞靶向、內(nèi)吞逃逸、基因釋放到載體代謝一系列生物學(xué)過程的每一個(gè)環(huán)節(jié)。根據(jù)這一思路，我們用體內(nèi)天然存在

2、的單體作為基本構(gòu)建單元合成了能夠兼顧上述一系列功能聚陽離子基因載體。 本論文首先總結(jié)了聚陽離子非病毒載體的研究現(xiàn)狀和目前存在的問題，并提出我們的聚陽離子的設(shè)計(jì)思路，然后分三個(gè)部分分別介紹聚陽離子載體的合成和化學(xué)表征，聚合物與質(zhì)粒形成的復(fù)合物的物理化學(xué)表征，以及聚合物的體外生物學(xué)活性。 首先是聚陽離子載體的合成，先將精胺分子中的伯胺基團(tuán)保護(hù)，然后以乙二醇二氯甲酸酯為連接劑，連接小分子精胺，產(chǎn)物脫保護(hù)后得到具有氨酯結(jié)構(gòu)的線狀

3、聚合物，通過化學(xué)結(jié)構(gòu)表征，確認(rèn)得到了目標(biāo)產(chǎn)物，凝膠滲透色譜測得聚合物的分子量為1144，降解實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，聚合物的降解時(shí)間比我們預(yù)期的要長。 然后是聚合物與質(zhì)粒形成的復(fù)合物的物理化學(xué)表征，在質(zhì)量比大于3時(shí)，聚合物就可以完全的保護(hù)DNA，并形成結(jié)構(gòu)緊密的納米粒，納米粒的平均粒徑為55nm，表面Zeta 電位為33mV，顯示出復(fù)合物形成的納米分散體系較為穩(wěn)定，不會(huì)發(fā)生聚集。這些特性都表明聚合物是理想的用于基因輸送的材料。 最

4、后是聚合物的生物學(xué)活性測試，聚合物對于熒光素酶和綠色熒光蛋白兩種報(bào)告基因都具有較好的轉(zhuǎn)染效果，在COS-7和293ft細(xì)胞中都能夠高效表達(dá)報(bào)告基因，在質(zhì)量比7-10時(shí)對COS-7的轉(zhuǎn)染效率比陽性對照組PEI25kDa 高出一倍。探針示蹤實(shí)驗(yàn)證實(shí)聚合物能夠包裹著基因物質(zhì)成功逃逸出溶酶體，然后靶向在細(xì)胞核附近。 siRNA基因沉默實(shí)驗(yàn)中，聚合物也顯示出高的基因沉默作用。在這些高效轉(zhuǎn)染基因物質(zhì)的基礎(chǔ)上，細(xì)胞毒結(jié)果顯示，聚合物具有比目前