ZHY抗腫瘤作用及機制研究.pdf

1、目的：研究ZHY水溶液及其乙醇提取物的抗腫瘤作用，初步探討ZHY乙醇提取物誘導腫瘤細胞凋亡的機制，并就ZHY水溶液的免疫調(diào)節(jié)功能作初步研究，以提供一種新的抗腫瘤藥物來源。
　　 方法：
　　 ①ZHY水溶液及其乙醇提取物抗腫瘤作用研究：采用動物移植性腫瘤模型觀察受試物對小鼠Lewis肺癌、H22肝癌、S180肉瘤生長的影響，驗證ZHY水溶液及其乙醇提取物的體內(nèi)抗腫瘤活性；采用MTT法、集落形成實驗、生長曲線法觀察ZHY乙

2、醇提取物對多種體外培養(yǎng)腫瘤細胞的增殖抑制作用。
　　 ②ZHY乙醇提取物誘導Bel-7402細胞、K562細胞凋亡的研究：采用3H-TdR摻入法觀察ZHY乙醇提取物對Bel-7402細胞DNA合成的影響；利用Hoechst33342熒光染色觀察受試物對Bel-7402細胞、K562細胞形態(tài)的影響；采用流式細胞術(shù)觀察受試物對Bel-7402和K562細胞凋亡百分比及細胞周期的影響；提取小分子DNA觀察受試物對實驗細胞株DNA片斷形

3、成的影響；采用免疫印跡法觀察受試物對細胞中P53、Bcl-2蛋白表達的影響；采用RT PCR法觀察受試物對Bel-7402細胞、K562細胞中p53、bcl-2、bcl-xl、bad、bax mRNA表達的影響。
　　 ③ZHY水溶液免疫調(diào)節(jié)活性研究：采用正常小鼠模型、環(huán)磷酰胺免疫抑制模型、腫瘤接種免疫抑制模型觀察ZHY水溶液對機體免疫功能的影響。觀察指標包括動物體重變化、脾指數(shù)、胸腺指數(shù)、小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化功能、外周血血清溶血

4、素生成能力、脾淋巴細胞T細胞亞群分布及其在ConA、LPS誘導下分泌IL-2、IL-6、IFN-γ和TNF-α的能力。
　　 結(jié)果：
　　 ⑴ZHY水溶液及其乙醇提取物的抗腫瘤活性研究。ZHY水溶液可有效抑制動物移植性腫瘤小鼠Lewis肺癌、H22肝癌、S180肉瘤的生長，并具有一定的劑量反應(yīng)關(guān)系和良好的可重復性。500mg/kg ZHY水溶液連續(xù)給藥10次，其腫瘤抑制率為43％～48％。
　　 ZHY乙醇提取物

5、對S180肉瘤生長的抑制作用與同等生藥劑量的ZHY水溶液生藥混懸液無明顯差異，且該作用具有良好的可重復性，提示ZHY乙醇提取物中包含了ZHY水溶液主要抗腫瘤活性成分，ZHY乙醇提取物可代表ZHY水溶液生藥的抗腫瘤活性?？紤]到受試物的溶解度，體外實驗選用ZHY乙醇提取物作為受試對象。以MTT法和集落形成法測定ZHY乙醇提取物對不同類型腫瘤細胞的殺傷或生長抑制作用，結(jié)果表明ZHY乙醇提取物可抑制多種腫瘤細胞的增殖，具有廣譜抗腫瘤活性；其IC

6、50值在20～50mg/L之間。生長曲線法測定結(jié)果表明，ZHY乙醇提取物可明顯抑制Bel-7402、K562的增殖，但對達峰時間影響不明顯。
　　 ⑵ZHY乙醇提取物誘導Bel-7402、K562細胞凋亡的研究。Hoechest33342熒光染色形態(tài)觀察結(jié)果顯示，隨著受試物劑量的增高，各受試物組出現(xiàn)的核亮染細胞百分比增高，且細胞染色質(zhì)凝聚，并逐漸斷裂形成核碎片，在200、300mg/L*6h ZHY乙醇提取物組可見到明顯的核斷裂

7、和凋亡小體。流式細胞術(shù)檢測表明，隨受試物濃度增高，凋亡細胞百分比增加，300mg/L組可見明顯的凋亡峰；但是ZHY乙醇提取物對Bel-7402細胞、K562細胞的增殖周期無明顯影響。小分子量DNA電泳發(fā)現(xiàn)在高濃度組出現(xiàn)典型的DNA階梯狀電泳條帶。表明，ZHY乙醇提取物能有效誘導腫瘤細胞Bel-7402、K562凋亡。Western Blot試驗結(jié)果表明，該受試物能上調(diào)P53蛋白表達、下調(diào)Bcl-2蛋白的表達。RT PCR試驗發(fā)現(xiàn)受試物可

8、促進p53、bad和bax mRNA的表達，抑制bcl-2，bcl-x1 mRNA的表達，顯著下調(diào)bcl-2/bax和bcl-xl/bad的相對比值。推論調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因與蛋白的表達可能是該受試物誘導細胞凋亡的途徑。
　　 ⑶ZHY水溶液對機體免疫功能影響的研究。不同劑量ZHY水溶液連續(xù)給藥20天對正常小鼠的體重無明顯影響；隨受試物劑量增加，小鼠脾指數(shù)、胸腺指數(shù)、由ConA和LPS誘導的脾淋巴細胞的轉(zhuǎn)化功能、外周血血清溶血素生成

9、能力有增加趨勢，但除外周血血清溶血素生成能力與空白對照組相比具有顯著性差異外，其他各組指標數(shù)據(jù)與空白對照組之間的差異不顯著。ZHY水溶液可改善注射環(huán)磷酰胺所引起的小鼠胸腺指數(shù)降低、由ConA和LPS誘導的脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化能力下降、外周血血清溶血素生成能力減弱、脾淋巴細胞中CD4+T細胞的百分含量和CD4/CD8比值下降的狀況，但對小鼠體重下降、脾臟腫大以及脾淋巴細胞中CD8+T細胞的百分含量降低無明顯影響。ZHY水溶液可減輕腫瘤接種引起的

10、小鼠脾臟腫大，提高腫瘤接種免疫抑制小鼠脾淋巴細胞由ConA和LPS誘導的轉(zhuǎn)化和增殖能力，提高荷瘤鼠脾淋巴細胞中CD4+和CD8+細胞的百分含量，且CD8+細胞百分比增長幅度大于CD4+細胞，導致CD4/CD8比值下降。受試物可促進荷瘤小鼠脾淋巴細胞由ConA誘導的IL-2、IL-6、IFN-γ的分泌以及LPS誘導的TNF-α的分泌。但受試物對小鼠體重增長減少、胸腺指數(shù)降低狀況無明顯影響。
　　 結(jié)論：以上研究結(jié)果表明，ZHY水溶