高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒抑制B2M基因表達(dá)的分子機(jī)制及其生物學(xué)意義.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染所引起的，主要導(dǎo)致母豬的繁殖障礙和仔豬的呼吸道疾病，同時(shí)該病具有免疫抑制和免疫逃逸的特性，有多種策略來逃避宿主的免疫清除作用和抑制宿主的免疫應(yīng)答，造成持續(xù)性感染。主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ(MHC-Ⅰ)存在于所有有核細(xì)胞的表面，主要參與內(nèi)源性抗原的提呈，特別是病毒抗原。MHC-Ⅰ將經(jīng)過加工的

2、病毒抗原提呈至感染細(xì)胞表而，從而被CD8+T淋巴細(xì)胞所識別，活化的CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞可以有效的清除被感染細(xì)胞，完成對病毒的清除作用。豬白細(xì)胞抗原Ⅰ(SLA-Ⅰ)是豬的主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ類分子，也是由重鏈和β2m構(gòu)成，其中β2m具有維持MHC-Ⅰ結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的功能，而且在MHC-Ⅰ與抗原多肽的結(jié)合中發(fā)揮重要作用。自然界中，多種病毒具有不同的機(jī)制來干擾宿主對病毒抗原的提呈來逃避機(jī)體的免疫清除。而且有研究報(bào)道，PRRSV可以通過增加M

3、HC-Ⅰ分子的泛素蛋白酶體降解來實(shí)現(xiàn)下調(diào)肺泡巨噬細(xì)胞(PAMs)表面MHC-Ⅰ分子的表達(dá)。為了進(jìn)一步解析PRRSV下調(diào)細(xì)胞表面表面MHC-Ⅰ分子表達(dá)的機(jī)制，開展了本文的研究，希望能夠通過更多研究來對PRRSV的免疫抑制和免疫逃逸機(jī)制提供更多樣化的科學(xué)解釋。
　　首先，利用流式細(xì)胞術(shù)和間接免疫熒光的方法分析了PRRSV可以導(dǎo)致專職的抗原提呈細(xì)胞如PAMs、骨髓來源的樹突狀細(xì)胞(BMDCs) MHC-Ⅰ分子表面表達(dá)下降以及可以感染PR

4、RSV的猴源細(xì)胞Marc145的細(xì)胞表面MHC-Ⅰ分子的表達(dá)下降。進(jìn)一步，本研究主要以高致病性的PRRSV毒株和Marc145細(xì)胞為材料，分別用針對MHC-Ⅰ-HC和β2m的單克隆抗體分析了細(xì)胞內(nèi)MHC-Ⅰ和β2m的蛋白水平，結(jié)果顯示PRRSV感染能夠顯著下調(diào)Marc145中MHC-Ⅰ和β2m的蛋白表達(dá)。當(dāng)使用泛素化酶E1的抑制劑PYR41抑制蛋白的泛素化降解之后，β2m的蛋白水平依然無法恢復(fù)，而且realtime qPCR結(jié)果也顯示，

5、PRRSV可以降低Marc145以及PAMs內(nèi)B2M(B2M基因編碼β2m蛋白)的mRNA水平，即PRRSV可以抑制B2M的轉(zhuǎn)錄水平。
　　然后，構(gòu)建表達(dá)PRRSV各個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白的真核載體，將其轉(zhuǎn)染Marc145和PK-15細(xì)胞，利用流式細(xì)胞術(shù)分析。結(jié)果表明，表達(dá)病毒非結(jié)構(gòu)蛋白4(Nsp4)的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的Marc145細(xì)胞和PK-15細(xì)胞表面MHC-Ⅰ分子的表達(dá)是下降的，同時(shí)B2M的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平也是降低的。<

6、br>　　接下來，通過構(gòu)建包含不同轉(zhuǎn)錄調(diào)控原件的B2M啟動(dòng)子調(diào)控區(qū)域序列，雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測結(jié)果表明Nsp4可以通過與B2M轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域的調(diào)控元件結(jié)合抑制B2M的轉(zhuǎn)錄。ChIP-PCR結(jié)果也證明，Nsp4蛋白可以與B2M啟動(dòng)子調(diào)控區(qū)域序列結(jié)合，調(diào)控B2M的轉(zhuǎn)錄。
　　綜上所述，本文的研究表明，PRRSV可以通過抑制B2M的轉(zhuǎn)錄水平而降低β2m的蛋白表達(dá)量，從而下調(diào)細(xì)胞表面MHC-Ⅰ分子的表達(dá)，進(jìn)一步影響病毒抗原的提呈，從而