大菱鲆粘膜及淋巴細胞對遲緩愛德華氏菌免疫應答的研究.pdf

1、大菱鲆(Scophthalmus maximus)是珍貴的海洋經(jīng)濟魚類，目前已經(jīng)在我國大規(guī)模養(yǎng)殖。隨著高密度工廠化養(yǎng)殖的迅速發(fā)展，諸多疾病相繼出現(xiàn)，造成了重大的經(jīng)濟損失，其中，腹水病是危害最大的疾病之一，其病原是遲緩愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)。目前，對魚類細菌病的防治方法主要采取頻繁使用抗生素及化學藥品的方法，其所帶來的耐藥性、食品及環(huán)境安全問題愈加突出。因此，免疫成為防治魚類細菌性疾病的安全有效方法。本文采用組

2、織制片觀察、單克隆抗體免疫組化標記、間接熒光法和流式細胞術(shù)等手段，首先，對不同年齡的養(yǎng)殖大菱鲆粘膜及淋巴細胞進行研究，描述并比較了不同年齡大菱鲆的粘膜及免疫組織的細胞學基礎；然后，以置備的遲緩愛德華氏菌滅活全菌和主要OPM為抗原，對大菱鲆進行腹腔注射、直接浸泡和肛門灌注免疫接種，以Ig+細胞相對數(shù)量及血清特異抗體凝集效價為指標，對大菱鲆粘膜免疫與系統(tǒng)免疫應答進行評價和比較，闡述了大菱鲆粘膜組織具有相對獨立的特異性免疫應答功能，以及不同抗

3、原的免疫效果。具體研究內(nèi)容和結(jié)果如下： (1)大菱鲆粘膜及免疫組織的細胞學基礎研究。組織切片顯微觀察發(fā)現(xiàn)，大菱鲆皮膚、鰓、后腸、頭腎和脾中存在淋巴細胞。利用大菱鲆IgM單抗免疫組化標記發(fā)現(xiàn)，除皮膚外，鰓、后腸、頭腎和脾中均原位存在Ig+細胞，其中，鰓組織中Ig+細胞存在于鰓小片的上皮與支持細胞之間的間隙中，后腸Ig+細胞存在腸道的固有層和粘膜下層中，外周血Ig+細胞主要存在于淋巴細胞群中，脾Ig+細胞分布在實質(zhì)區(qū)，且更傾向于分布

4、在脾竇周圍，頭腎Ig+細胞無規(guī)律地散布于腎組織中。采用間接熒光標記和流式細胞儀對受精后2.5和10月齡大菱鲆的皮膚、鰓、后腸、外周血和頭腎中Ig+細胞進行檢測、分析后發(fā)現(xiàn)，同一年齡大菱鲆的不同組織中Ig+細胞的數(shù)量不同，同時，不同年齡魚的同一組織的Ig+細胞數(shù)量也有差異。2.5月齡大菱鲆Ig+細胞分布為：皮膚0.00±0.00％、鰓1.58+0.40％、后腸2.53±0.70％、外周血17.0±0.39％和頭腎21.0±1.79％；10

5、月齡魚Ig+細胞分布為：皮膚0.94±0.74％，鰓1.60±0.71％、后腸3.91±1.06％、外周血28.95+0.39％和頭腎21.54+0.90％。 (2)遲緩愛德華氏菌的分離、鑒定及抗原的制備。從患腹水病大菱鲆體內(nèi)分離純化出主要病原菌株，用生化鑒定及16S rRNA基因序列測定和分析方法鑒定為遲緩愛德華氏菌；用0.5％福爾馬林滅活法，制備了安全的遲緩愛德華氏菌滅活全菌抗原；用Sarkosyl法，制備了安全的遲緩愛德華

6、氏菌主要OPM抗原。 (3)大菱鲆粘膜及淋巴細胞對遲緩愛德華氏菌滅活全菌抗原的免疫應答。直接浸泡后，鰓組織中的Ig+細胞數(shù)量的出現(xiàn)峰值時間比外周血、頭腎組織提前7天，鰓中的Ig+細胞數(shù)量極顯著高于未免疫組，而外周血和頭腎的Ig+細胞數(shù)量與未免疫組大菱鲆差異不顯著：腹腔注射后，鰓組織Ig+細胞數(shù)量的出峰值時間與外周血、頭腎相同，鰓中Ig+細胞數(shù)量與對照組差異不顯著，且極顯著低于浸泡免疫組，外周血和頭腎的Ig+細胞數(shù)量則極顯著高于對

7、照組及浸泡免疫組。另外，浸泡免疫后，免疫魚體針對全菌抗原的血清抗體效價顯著高于對照組，且其達到峰值的時間與浸泡免疫后鰓組織中Ig+細胞的峰值時間相同，表明浸泡免疫后大菱鲆的血清特異抗體主要來源于鰓組織中Ig+細胞的特異性免疫應答。 (4)大菱鲆粘膜及淋巴細胞對不同抗原的免疫應答。用遲緩愛德華氏菌滅活全菌及主要OPM分別對大菱鲆進行腹腔注射、直接浸泡和肛門灌注免疫后發(fā)現(xiàn)，注射OPM的大菱鲆外周血中Ig+細胞數(shù)量和血清抗體效價均不顯

8、著低于注射遲緩愛德華氏菌滅活全菌大菱鲆；浸泡OPM大菱鲆鰓中Ig+細胞數(shù)量和血清抗體效價均不顯著高于浸泡滅活全菌的大菱鲆，肛門灌注OPM大菱鲆后腸、外周血中Ig+細胞相對數(shù)量和血清抗體效價均不顯著高于注射滅活全菌大菱鲆。 本文研究結(jié)果表明，粘膜組織具有特異性免疫應答的組織細胞學基礎，對抗原可以產(chǎn)生顯著的相對獨立的特異性免疫應答；大菱鲆體內(nèi)存在粘膜免疫和系統(tǒng)免疫，不同免疫途徑對不同免疫組織的誘導作用不同，浸泡免疫主要誘導體表粘膜組