衰老及肥胖大鼠肝臟糖代謝相關基因的表觀遺傳學研究.pdf

1、人口老齡化是全球只趨面臨的挑戰(zhàn)，其中涉及到健康和疾病等問題。機體隨年齡增長常伴隨肥胖，而衰老和肥胖又能夠引發(fā)2型糖尿病(Type2 diabetesmellitus，T2DM)等許多代謝性疾病。隨著近幾年代謝綜合征(Metabolicsyndrome，MS)研究的不斷深入，研究者發(fā)現(xiàn)MS共同的病理生理基礎是胰島素抵抗(insulin resistance，IR)，2007年國際糖尿病聯(lián)盟(DF)在第二屆“糖尿病前期和代謝綜合癥”國際會議

2、上已經(jīng)把糖尿病前期的發(fā)病機制闡述為胰島素抵抗，可見胰島素抵抗在糖尿病的發(fā)病過程中具有重要的意義。
　　 衰老(年齡增長)和肥胖是增加胰島素抵抗發(fā)生的兩個獨立危險因素。隨著人類壽命的延長，闡明增齡和肥胖產(chǎn)生胰島素抵抗的發(fā)生機理，對不同年齡人群，特別是老年人的健康及疾病的預防具有重要的指導價值。但到目前為止，胰島素抵抗的分子生物學機制還不是十分清楚，而表觀遺傳改變有助于將環(huán)境、年齡與疾病發(fā)生風險聯(lián)系起來，目前已有證據(jù)顯示表觀遺傳在細

3、胞和器官的衰老中扮演著重要的角色。在人類隨年齡增長逐漸衰老的過程中，表觀遺傳標記比DNA序列更易受到環(huán)境因素的影響而發(fā)生變化，它的輕微變化就可能打開或關閉基因的表達從而產(chǎn)生一系列的影響，對胰島素抵抗及糖尿病的發(fā)病可能具有重要的意義。肝臟是胰島素作用的關鍵器官，肝臟對胰島素的敏感性降低將導致肝臟的葡萄糖利用降低以及葡萄糖輸出增加，與糖尿病的發(fā)病密切相關。研究肝臟在胰島素抵抗以及糖尿病發(fā)病機理中的作用對于探討糖尿病的病因以及治療糖尿病具有重

4、要意義。本課題擬從衰老和肥胖兩方面探討肝臟糖代謝相關基因的表觀遺傳學調(diào)控機制，為闡述胰島素抵抗和糖尿病的分子生物學發(fā)生機制提供依據(jù)。
　　 方法和結果：
　　 一、不同鼠齡大鼠肝臟糖代謝相關基因的表觀遺傳學研究：
　　 1.大鼠的基本指標：14周齡(年輕鼠)、40周齡(中年鼠)和80周齡(老年鼠)的Wistar大鼠空腹血糖均正常，但空腹胰島素水平隨鼠齡增高而增高，表明中年及老年鼠處于胰島素抵抗階段。
　　

5、 2.肝臟糖代謝相關基因的表達水平：肝臟糖代謝基因Glut2，Gck和L-PK基因的表達水平均隨大鼠的鼠齡增加而降低，肝臟的糖原水平也隨鼠齡的增加而逐漸降低。
　　 3.不同鼠齡大鼠肝臟糖代謝相關基因的表觀遺傳學研究：
　　 (1)建立了一種定量DNA甲基化的簡單可行的方法，即DNA經(jīng)亞硫酸氫鹽處理后PCR擴增并直接測序，根據(jù)測序峰值圖中“T”和“G”堿基的峰高計算CpG位點的甲基化程度。
　　 (2)利用該甲基

6、化定量的方法，檢測了Glut2、Gck和L-PK基因啟動子的DNA甲基化程度，發(fā)現(xiàn)Glut2基因的啟動子區(qū)甲基化程度在不同鼠齡大鼠肝臟中不存在差異，而Gck和L-PK基因啟動子的DNA甲基化程度隨大鼠鼠齡增加而逐漸增高，呈現(xiàn)明顯的年齡依賴性特點，提示肝臟Gck和L-PK基因啟動子區(qū)的甲基化程度與其基因的轉錄水平可能存在負相關關系。
　　 二、肥胖大鼠肝臟糖代謝相關基因與表觀遺傳學的研究肥胖是機體產(chǎn)生胰島素抵抗的重要因素之一，我們

7、探討了表觀遺傳學機制在肥胖所致的胰島素抵抗中的作用：
　　 1.肥胖大鼠模型的建立：大鼠4周齡開始給予高脂飼料喂養(yǎng)，大鼠體重隨喂養(yǎng)時間延長而顯著增加，喂養(yǎng)8周(鼠齡為12周)后成功地建立了肥胖合并胰島素抵抗的大鼠模型。
　　 2.肥胖大鼠肝臟糖酵解的兩個關鍵基因Gck和L-PK的表達水平顯著低于正常大鼠；肥胖大鼠的肝糖原顯著低于正常體重大鼠。
　　 3.肥胖大鼠Gck和L-PK基因啟動子的甲基化程度顯著高于正常體

8、重大鼠，說明這兩個基因啟動子區(qū)的甲基化程度與基因的轉錄水平可能是一種負相關關系，提示肥胖可能是影響肝臟Gck和L-PK啟動子甲基化程度的重要因素之一。
　　 三、游離脂肪酸誘導的胰島素抵抗肝細胞的表觀遺傳學研究通過建立胰島素抵抗肝細胞模型，在細胞水平上進一步研究表觀遺傳學與胰島素抵抗之間的關系：
　　 1.胰島素抵抗肝細胞模型的基因表達變化：濃度為0.1mM的PA誘導大鼠正常肝細胞株BRL細胞24h后即成胰島素抵抗細胞模

9、型(BRL/IR)。該細胞的Gck基因轉錄、翻譯及酶活均顯著降低，肝糖原含量顯著降低。
　　 2.胰島素抵抗肝細胞模型的Gck啟動子區(qū)甲基化程度的變化：Gck啟動子區(qū)的甲基化程度幾乎在所有的CpG位點中都稍有增加，提示Gck基因表達與啟動子區(qū)的甲基化之間可能存在負相關關系；去甲基化試劑5-Aza-CdR處理過的BRL/IR細胞Gck基因表達水平顯著提高。
　　 3.藥物鹽酸小檗堿(BBR)對BRL/IR細胞的療效觀察：B

10、BR能夠顯著提高BRL/IR細胞的葡萄糖消耗量及肝糖原含量；顯著增加Gek基因在轉錄及翻譯水平上的表達量以及Gck的活性；顯著降低BRL/IR細胞內(nèi)聚集的TG含量。BBR處理過的BRL/IR細胞Gck啟動子區(qū)的甲基化程度稍降低，提示去甲基化機制可能參與了BBR藥物對Gck基因轉錄水平的調(diào)控。
　　 4.表達Gck siRNA和Gck基因的腺病毒制備及對胰島素抵抗細胞作用的初步研究：成功制備了表達Gck RNA干擾的腺病毒Ad-G

11、ck-siRNA和表達Gck基因的腺病毒Ad-Gck。實驗證實Ad-Gck-siRNA腺病毒能夠顯著降低肝細胞的Gck基因表達量，顯著降低肝細胞的葡萄糖消耗量以及肝糖原含量；Ad-Gck腺病毒能夠在肝細胞內(nèi)過量表達Gck基因，顯著提高BRL/IR細胞的葡萄糖消耗量以及肝糖原含量。通過在肝細胞中過量表達或抑制表達Gck基因，初步證實了Gck基因在肝細胞的胰島素抵抗狀態(tài)中具有重要的作用，為今后在動物體內(nèi)進行Gck基因的功能研究打下了基礎。<

12、br>　　 結論：胰島素抵抗是逐步發(fā)展形成的，而衰老和肥胖是產(chǎn)生胰島素抵抗的兩個重要因素，并與葡萄糖代謝密切相關。本課題即從表觀遺傳學的角度分析衰老及肥胖大鼠發(fā)生胰島素抵抗的分子生物學機制，發(fā)現(xiàn)了肝臟糖代謝關鍵基因Gck和L-PK在衰老和肥胖兩種胰島素抵抗大鼠肝臟中均存在啟動子區(qū)的甲基化程度與基因表達的負相關關系，影響了肝臟的胰島素利用及葡萄糖代謝，是參與胰島素抵抗的重要機制。藥物BBR能夠上調(diào)胰島素抵抗肝細胞的Gck基因表達量，同時